本发明专利技术涉及衍生自与细胞关联受体相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的至少２种可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞表面上的膜受体的表达的用途，所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域（ＲＢＤ）之一的一部分或全部，并且所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的所述至少一种膜受体相互作用，所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行，并且允许确定所述靶细胞的生理状态。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型受体结合配体及其在检测具有生物学益处的细胞中的用途病毒受体结合结构域(RBD)特别发现于病毒的包膜糖蛋白(Env)中，其能够结合不同靶细胞的膜受体。修正基因缺陷的基因治疗策略基于逆转录病毒具有的转移基因的性质，所述逆转录病毒的Env由实验员选择。用于治疗Y链的免疫缺陷的两个临床研究基于由Y逆转录病毒衍生的载体介导的基因至人造血干细胞内的转移(Cavazzana-Calvo ；Science 2000和Gaspard ；Lancet 2004)。然而，两个研究的结果极不相同并且对于一些患者，以不同的速率发生淋巴组织增殖性疾病。本专利技术的一个目的是提供用于检测存在于靶细胞中的膜受体的新型受体结合配体。本专利技术的另一个目的是提供基于膜受体的特征性阵列鉴定靶细胞，特别是干细胞和其衍生的细胞的鉴定方法。本专利技术的另一个目的是提供用于选择具有生物学益处(biological interest)的细胞(特别是干细胞和其衍生的细胞)的亚群的实现方法。本专利技术的另一个目的是提供扩增选择的靶细胞的扩增方法。本专利技术的另一个目的是提供检测特定膜受体在具有生物学益处的靶细胞上的存在的检测方法。本专利技术的另一个目的是提供获得所述受体结合配体的方法。本专利技术涉及至少2种衍生自与细胞关联受体(cognate rec印tor)相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞的表面上的膜受体的表达的用途，-所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域(RBD)之一的一部分或全部，和，-所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的至少一种膜受体相互作用，所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行，并且允许确定所述靶细胞的生理状态。术语“配体”是指多肽。表述“衍生自有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分”意指受体结合配体是病毒的包膜中包含的糖蛋白的片段或部分并且可以例如通过克隆获得。术语“糖蛋白”是指包膜糖蛋白、衣壳糖蛋白(coat glycoprotein)或融合糖蛋白。表述“与细胞关联受体相互作用”意指糖蛋白易于被存在于细胞表面上的受体识别。可向糖蛋白的该片段或部分的肽序列加入、缺失或置换一个或多个氨基酸。可化学修饰包含RBD的部分或全部的受体结合配体，以添加荧光染料。RBD特别地发现于病毒的包膜的糖蛋白中，因此，受体结合配体包含完整RBD或所述RBD的片段或部分。所述RBD的部分或全部易于与靶细胞的至少一种膜受体相互作用。“靶细胞”意指呈现锚定在细胞的膜内的受体的特征性阵列的具有生物学益处的细胞。可以从哺乳动物，例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞，更具体地干细胞(优选在分化过程中)，或从癌细胞分离靶细胞。干细胞的实例(但不限于它们)是胚胎干细胞、造血干细胞、神经和间质前体干细胞(neural and mesenchymatous precursor stem cell)、癌症干细胞。还可从组织或器官分离靶细胞。病毒的糖蛋白的RBD能够结合靶细胞的一种或多种膜受体。“膜受体”，其在本文中被定义为锚定在细胞质膜中的任意蛋白质或多肽。所述膜受体允许与病毒的糖蛋白相互作用。优选地，根据本专利技术的膜受体是用作转运蛋白例如营养物和代谢物转运蛋白的多次跨膜蛋白家族的成员，即允许营养物和代谢物运输穿过质膜的多次跨膜蛋白。所有哺乳动物细胞通过细胞表面上的“营养物或营养品转运蛋白”吸收必需营养物并且排出分解代谢产物和其他成分，从而允许细胞存活(细胞凋亡的抑制、自噬的抑制、 增殖等)。营养物或营养品以及代谢物或分解代谢产物是例如碳水化合物、氨基酸、无机磷酸盐、核苷、脂质、维生素、血红素、离子等。该靶细胞必须被所述RBD识别。表述“所述受体结合配体易于与至少一种膜受体相互作用”意指，所述受体结合配体通过RBD与靶细胞的受体或靶细胞的若干受体形成复合物。可溶性受体结合配体还可包含超过1个的RBD (以其完全或部分序列)。因此可在其中之前已从动物分离靶细胞的情况下体外形成复合物。还可离体形成复合物。还可在其中受体结合配体被注射入哺乳动物并且与动物生物体中的靶细胞相互作用的情况下体内形成复合物为了获得如上定义的靶细胞的膜受体与配体之间的相互作用，受体结合配体必须以足以与膜受体形成复合物的浓度存在。表述“鉴定和定量存在于靶细胞的表面上的膜受体的表达”意指当靶细胞表达膜受体时，即所述受体存在于靶细胞的表面上时，在具有生物学益处的靶细胞的膜受体与受体结合配体之间形成复合物。如果受体结合配体已例如(但不限于)用可检测的分子例如抗体恒定片段(Fe) 或荧光化合物(花青素、alexa、量子点......)共价偶联，那么可检测该复合物。如果已用本领域技术人员公知的不同方法用标签标记了受体结合配体，那么也可检测该复合物。例如，但不限于，用于本专利技术的标签(tag)可以是血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、Myc标签、Str印标签、Flag标签、S-标签、HAT标签、3x Flag标签、钙调素结合肽标签、SBP标签、壳多糖结合结构域标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、GFP和EGFP标签、RFPs标签、YFP标签、CFP标签、T7标签、V5标签、Xpress标签以及可从Olympus America Inc获得的具有445nm至655nm之间的最大发射的所有荧光分子。因此，受体结合配体的使用允许，一方面依赖于所使用的受体结合配体鉴定靶细胞上表达的受体，并且另一方面定量形成的复合物，从而确定膜受体在靶细胞上的存在或不存在以及其量。表述“在给定的时间或在给定的时间间隔期间”意指可以紧在受体结合配体与靶细胞的膜受体接触后，或当评估靶细胞上所述膜受体的衰减时，取决于细胞和接触条件，在所述接触后数分钟(特别是1至59分钟)，或数小时(特别是1至47小时，优选M小时)， 或数天(特别是2至7天，优选3天)，或数周(优选3至6周)检测和/或定量所形成的复合物，以评估膜受体的表达的改变。接触条件还包括温度，取决于靶细胞，所述温度可为0°C至37°C，特别地0、1、2、3 或4°C，优选接近室温，特别地18°C至25°C，特别地18、19、20、21、22、23、24或25°C，更优选 26 至 37°C，特别地 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36 或 37°C，优选 30 或 37°C。表述“生理状态”意指，受体结合配体不仅允许确定存在于靶细胞中的膜受体的表达，而且还允许确定此类膜受体是存在于细胞表面上还是存在于细胞内库(intracellular pool)中。通常，通过在固定或透化细胞膜之前将靶细胞与所述受体结合配体接触，然后检测所述膜受体来表征细胞表面上所述膜受体的可获得性(availability)。可在用适当的去垢剂(Tween、NP40、Nonidet等)或固定剂溶剂(丙酮、乙醇、甲醇、甲醛、多聚甲醛等)固定或透化所述靶细胞后通过接触来检测整个库(细胞表面和细胞内)。此外，取决于在接触过程中使用的条件，即温育条件(温度、培养基、时间......)，受体结合配体允许检查膜受体的变化，即膜受体表达的变化。因此，受体结合配体是细胞的生理状态的标志物。因此本专利技术的有利方面之一是，不仅提供细胞的生理状态的标志物，而且本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．至少２种衍生自与细胞关联受体相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞表面上的膜受体的表达的用途，－所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域（ＲＢＤ）之一的一部分或全部，和，－所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的至少一种膜受体相互作用，所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行，并且允许确定所述靶细胞的生理状态。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·西特邦，
申请(专利权)人：国家科研中心，
类型：发明
国别省市：FR
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