一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法。目前，单克隆抗体和重组DNA技术的结合使得构建在正常自然条件下所存在的以抗体为基础的生物分子成为可能，但单克隆抗体治疗肿瘤其药物的靶向传递效率依然未能达到理想水平。本发明专利技术通过应用抗体噬菌体呈现技术筛选具有抗包膜蛋白的特异性抗体，同时将其与抗肿瘤表面特异性标志物抗体的可变区片断构建成双向特异性抗体或者其它生物工程形式分子，从而建立可以在体内和体外特异性传递逆转录病毒的系统。本发明专利技术能阻断并封闭传递病毒的非特异性结构表位的结合能力；具有靶向和封闭逆转录病毒非特异性结合区的双重作用双重作用；并且不影响逆转录病毒制备的滴度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体涉及在体内和体外能够靶向传递逆转录病毒的高效基因治疗
，进一步涉及一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法。
技术介绍
目前，高效的基因治疗工具已经具备能够准确通过适当的载体将目的基因送达体内特异性细胞或者组织的特点。逆转录病毒，如慢病毒，因其自身具有稳定转染，可整合入基因组长期表达，以及促进感染细胞转化成为非分裂细胞等功能显示出了良好的应用前景。许多研究以病毒载体假型嵌和包膜相结合的方法研制开发出了针对慢病毒包膜蛋白的嵌合抗体，目前已经提高了慢病毒的基因传递特异性。在未来基因治疗领域中，这些研究工作为进一步修饰和改进传递载体系统方法的应用奠定了基础。在众多方法中一个相类似的策略就是应用非偶联的方法靶向识别细胞，这种方法是采用融合表达的方法使独立的蛋白表达在病毒载体的表面。该方法已被证实，其制备更为简便，同时可以促进γ逆转录病毒和慢病毒载体靶向特异性细胞。这种方法采用配体蛋白或者细胞特异性抗体作为桥梁在体外将载体靶向传递到未经修饰的具有禽肉瘤或者造血细胞组织增生病毒的特异性细胞包膜蛋白处。25年前，单克隆抗体和重组DNA技术的结合使得构建在正常自然条件下所存在的以抗体为基础的生物分子成为可能。其中，第一批双向特异性抗体，其表面类似普通免疫球蛋白分子，但是其中两个结合臂却具有截然不同的结合特异性。使用该种方法Staerz等人将双向特异性抗体结合于细胞毒性T细胞，从而达到靶向裂解肿瘤细胞的目的。从那以后，人们构建了不同种类的双向特异性抗体来靶向肿瘤细胞。但是，这种方法的特点和局限性也逐渐显示出来。与此同时，将双向特异性抗体结合于其他细胞毒性免疫细胞的生物工程治疗方法也已经陆续被研发和构建出来。例如：靶向巨噬细胞表面的FcgRI/CD64和肿瘤细胞表面的HER2/neu或者EGFR。同时，越来越多的嵌合抗体及其与化疗药物偶联的药物已经在试验中取得了良好的结果且被批准应用于肿瘤的临床治疗。尽管科研人员不断改进并减少生物工程制剂在临床应用过程中存在的问题，但单克隆抗体治疗肿瘤仍然具有其局限性，药物的靶向传递效率依然未能达到理想水平。然而，正是这些在临床治疗中存在的问题为生物工程药物的进一步改进提出了要求。临床治疗中，针对不同疾病的有效基因治疗方法应具备以下特点：利用最佳条件高效并特异性靶向传递治疗基因到目的细胞；同时，还要保持该基因的稳定转染和长期表达特性。目前，常采用血液直接注射的方法将药物引入体内，然后通过载体归巢的方法将目的基因靶向传递至细胞或者器官。因此，现阶段已经有研究应用生物工程和基因重组的方法以不同病毒载体为基础开发出靶向基因治疗传递系统。腺病毒和腺相关病毒载体已经因为它们具有结合和感染机理单一的优点而被应用于靶向基因传递策略。尽管这些经过改进的病毒载体已经被成功应用于体外靶向特异性细胞，但却因为它们自身的非特异导向性（特别是在肝脏细胞）以及改构以后影响病毒载体的感染能力等缺点，使得它们在体内的应用受到了限制。与腺病毒不同，逆转录病毒载体颗粒是介导多核酸进入细胞（如真核细胞）的另一种重要工具。“介导”一词包括多种将多核苷酸转移入细胞的方法。其中包括转化、转导和转染等。逆转录病毒是RNA病毒，因此病毒基因组是RNA，当宿主细胞感染逆转录病毒后，基因组RNA反转录成为DNA中间体，介导病毒基因高效整合入感染细胞的染色体DNA中。整合的DNA中间体是指前病毒。逆转录病毒家族是包膜单链RNA病毒，主要感染哺乳动物，如牛、猴、羊和人以及禽类和鼠类等。逆转录病毒在众多RNA病毒中，以它们通过RNA合成DNA拷贝并且能够整合入感染细胞的基因组的多种特殊方式而显示出其独特的应用价值。逆转录病毒家族中按照目前国际病毒分类标准，可分为7个属：α逆转录病毒属Alpharetrovirus，β逆转录病毒属 Betaretrovirus，γ逆转录病毒属Gammaretrovirus，δ逆转录病毒属 Deltaretrovirus，ε逆转录病毒属Epsilonretrovirus，慢病毒属 Lentivirus和泡沫病毒属 Spumavirus。其中，慢病毒包括：HIV-1、HIV-2和SIV；γ逆转录病毒包括：白血病病毒（鼠白血病病毒MLVs和猫白血病病毒）。如何将逆转录病毒应用于体内靶向特异性细胞或组织目前还是一个难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的方法，以克服克服现有技术存在的靶向传递逆转录病毒制备效率低、体内靶向性差的问题。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，依次包括下述步骤：步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白（VSV-G）以及特异性靶向标志物的抗体细胞。步骤二、分别构建相应的抗体噬菌体呈现文库，分别筛选能够与逆转录病毒包膜蛋白或特异性靶蛋白特异性结合的噬菌体个体。    步骤三、根据步骤二中筛选获得的噬菌体，将编码抗逆转录病毒包膜蛋白与特异性靶向标志物的单链可变区片断的cDNA克隆，重组表达双向特异性配体。步骤四、双向特异性配体与逆转录病毒载体的结合。上述步骤一中，特异性靶向标志物的抗体是指抗EGFR（EGF受体）、EpCAM（表皮细胞粘附分子）、EphA2（Eph受体酪氨酸激酶A2）、Her2（人EGF受体2）等特异性肿瘤或某种疾病的标志物分子。本专利技术中所描述的以双向特异性配体介导的逆转录病毒靶向体内细胞和组织的制备方法通过联合使用逆转录病毒以及双向特异性亲和配体将基因选择性传递到靶细胞或者组织。在以下具体的实施例中，逆转录病毒为慢病毒。其他逆转录病毒也可以在该系统中应用于靶向传递基因。选择性传递基因到靶细胞或者组织已经被广泛应用于肿瘤的治疗、感染性疾病的治疗和基因紊乱疾病的治疗等。本专利技术中所说的双向特异性亲和配体可以选择性结合逆转录病毒和靶向细胞或者组织。该配体可以先与逆转录病毒混合，然后应用于治疗；将二者同时应用于治疗；或者在病毒应用后再用配体治疗。双向特异性配体至少有2个结合区域。一个可以与逆转录病毒结合，另一个可以与靶细胞或者组织结合。2个结合部分通过共价键结合在一起。好的双向特异性配体不会抑制病毒与细胞的融合。其中，双向特异性配体包括：双向特异性抗体、双向特异性适体、双向特异性小分子及嵌合体（一个结合区域是小分子，另一个结合区是抗体）。本专利技术中，双向特异性配体可以包括2个以上的结合区域。例如：特异性结合于病毒表面蛋白的多适体。可以通过多聚体载体（例如：多赖氨酸，聚丙烯酸或类似物）形成双向特异性亲和配体被偶联于多个特异性靶向细胞表面蛋白的抗体。将双向特异性配体与病毒结合后，去除多余的未结合配体后即可用于治疗。同时，还可以通过偶联的方法将双向特异性配体共价偶联（或加入交联试剂进行偶联，例如戊醛或DIC）于病毒，但需要进一步确定双向特异性配体与病毒复合物的稳定性，。尽管，近来的许多研究证实慢病毒可以在体内以假型病毒的模式传递至特异性靶细胞。然而，重要的是细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，依次包括下述步骤：步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白（ＶＳＶ－Ｇ）以及特异性靶向标志物的抗体细胞；步骤二、分别构建相应的抗体噬菌体呈现文库，分别筛选能够与逆转录病毒包膜蛋白或特异性靶蛋白特异性结合的噬菌体个体；步骤三、根据步骤二中筛选获得的噬菌体，将编码抗逆转录病毒包膜蛋白与特异性靶向标志物的单链可变区片断的ｃＤＮＡ克隆，重组表达双向特异性配体；步骤四、双向特异性配体与逆转录病毒载体的结合。

【技术特征摘要】
1.一种双向特异性配体靶向逆转录病毒的制备方法，依次包括下述步骤：
步骤一、通过免疫小鼠制备抗逆转录病毒包膜蛋白（VSV-G）以及特异性靶向标志物的抗体细胞；
步骤二、分别构建相应的抗体噬菌体呈现文库，分别筛选能够与逆转录病毒包膜蛋白或特异性靶蛋白特异性结合的噬菌体个体；
步骤三、根据步骤二中筛选获得的噬菌体，将编码抗逆转录病毒包膜蛋白与特异性靶向标志物的单链可变区片断...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学明，刘镭，王天欣，
申请(专利权)人：西安杰诺瓦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：87