本发明专利技术涉及新的Melan-A表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途。具体而言，本发明专利技术公开了新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽及使用所述表位肽制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4+T淋巴细胞的方法。本发明专利技术还公开了在MHC-II类限制性下识别所述Melan-A表位肽的CD4+T淋巴细胞以及这些细胞在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的用途。本发明专利技术还涉及包括上述Melan-A表位肽的用于治疗或预防肿瘤的疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫治疗领域，具体涉及肿瘤特异性抗原Melan-A的表位肽及其在预防和/或治疗肿瘤中的用途。
技术介绍
免疫系统是人体抵御肿瘤的重要屏障。各种因素导致的肿瘤，如由于化学致癌剂或病毒导致的肿瘤，会使得肿瘤细胞出现表达突变蛋白、异位表达蛋白、正常蛋白表达水平过高和表达病毒蛋白等现象。在正常的免疫系统中，机体的免疫细胞可能会识别并清除这些异常细胞，从而使机体免于罹患肿瘤。而长期处于免疫抑制状态的人群，如器官移植、艾滋病患者等，肿瘤的发病率要远远高于正常人群。过继性T细胞免疫治疗则是肿瘤免疫治疗中的重要手段之一，专指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接或通过激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，以达到治疗目的的治疗方法(Nat Rev Cancer, 2008. 8 (4) 299-308)。输注的细胞包括LAK、NK细胞、T淋巴细胞等。在一定的条件下，这些方法都获得了一定程度上的成功。如NK细胞在造血干细胞移植后的抗白血病效应，美国癌症协会 (NCI)Rosenberg SA教授领导下进行的肿瘤浸润淋巴细胞对黑色素瘤的治愈率可以达到 50% 以上(Science, 2002. 298(5594) :850-854) 近年来，随着一系列被⑶4+T细胞识别的肿瘤抗原的鉴定，人们对于⑶4+T细胞在抗肿瘤免疫反应中的作用有了更进一步的认识。但CD4+T淋巴细胞运用于过继性免疫治疗中的例子并不多。CD4+T淋巴细胞虽然不同于细胞毒性T淋巴细胞(在胞浆内含有穿孔素和颗粒酶等效应分子)，但在识别靶细胞后，却可以分泌大量的IFN-γ、IL-2等Thl类细胞因子。这些细胞因子不仅可以通过自分泌或旁分泌的方式为其它淋巴细胞提供生长因子， 增强免疫提呈和淋巴细胞活化，而且可以直接促进肿瘤细胞的凋亡(Curr Opin Immunol, 2004. 16(3) :259-63)。⑶4+T细胞在机体抗肿瘤免疫反应中起着重要的作用，同时激活 ⑶4+T细胞和⑶8+T细胞是免疫治疗的理想策略。Melan-A为人类黑色素细胞分化抗原，表达于正常的黑色素细胞及几乎所有黑色素瘤患者的肿瘤细胞，而在其它组织中不表达(Melanoma Res, 1998. 8 (4) :337-43)。 Melan-A为黑色素瘤相关抗原中抗原性较强的一种，最易被体外黑色素瘤特异性多肽所激活的外周血淋巴细胞及肿瘤浸润淋巴细胞所识别。在Melan-A上有数个免疫优势表位，它们能在体内外诱导产生特异性T淋巴细胞免疫应答，因而在黑色素瘤特异性免疫治疗方面有着广阔的应用前景。专利技术概述本研究以亚洲人群为研究对象，通过合成长度为30个氨基酸，重叠部分为20个氨基酸的肽段覆盖Melan-A蛋白全长，在体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，产生对 Melan-A特异性反应的⑶4+T淋巴细胞，从而鉴定出新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽。 该表位肽可用于体外刺激产生对Melan-A具有特异性反应性的⑶4+T淋巴细胞。这些抗原特异性细胞，在接受抗原刺激后可以分泌大量可以直接或间接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，3因此能用于对表达Melan-A的肿瘤的过继性免疫治疗。该表位肽还可以用作预防和/或治疗表达Melan-A的肿瘤的疫苗。因此，在一个方面，本专利技术提供了新的MHC-II类限制性Melan-A表位肽。在另一个方面，本专利技术提供了制备对Melan-A具有特异性反应性的CD4+T淋巴细胞的方法。本专利技术还提供了识别本专利技术的Melan-A表位肽并在识别后发生特异性反应的 CD4+T淋巴细胞以及这些细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物中的用途。最后，本专利技术还提供了包括本专利技术的Melan-A表位肽的用于预防和/或治疗肿瘤的疫苗。附图说明图1 显示来自健康供者106 (HD106)的外周血单个核细胞经Melan-A混合肽刺激两周后出现对Melan-A的特异性反应。图2 显示来自HD106的对Melan-A具有特异性反应性的5号单克隆⑶4+T细胞对 Melan-A21^50的特异性反应。图3 来自HD106的5号单克隆CD4+T细胞对已知Melan-A表位肽的识别。图4 显示不同HLA阻断抗体对HD106的5号单克隆CD4+T细胞特异性反应的影响。图5 来自HD106的5号单克隆⑶4+T细胞对来源于不相关的健康供者(HD)的抗原提呈细胞所提呈的Melan-A21J的反应。图6 以来源于不相关的健康供者(HD)的抗原提呈细胞进行的HLA-DPBl高分辨分型检测结果。图7 来自HD106的5号单克隆CD4+T细胞识别天然Melan-A表位。专利技术详述本专利技术提供了分离的Melan-A表位肽，其由SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列组成。本专利技术的Melan-A表位肽是新的MHC-II类限制性表位肽，其能在HLA-DP限制性条件下被CD4+T 淋巴细胞特异性识别，具体地，本专利技术的Melan-A表位肽是HLA-DPB1*0501限制性表位肽。本文中，“表位肽”指的是包含抗原表位，在特定MHC限制性下能引起免疫反应的多肽或肽段。可以通过任何已知的制备多肽的方法获得本专利技术的分离的表位肽。例如本专利技术的分离的表位肽可以是合成的，如通过常规化学方法合成，这样的合成可以通过商业定制进行(如北京华大中生科技发展有限公司)。也可以通过基因工程方法得到本专利技术的分离的表位肽，如将编码表位肽的核酸序列插入合适表达载体中并转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，然后从培养物中回收表位肽。考虑到获得的方便性和纯度，本专利技术的表位肽优选是合成的。本专利技术还提供了一种制备对Melan-A具有特异性反应性的⑶4+T淋巴细胞的方法，包括以下步骤a)将起始细胞与本专利技术的Melan-A表位肽在抗原提呈细胞存在的条件下在培养基中共培养；和b)分离发生特异性反应的⑶4+T淋巴细胞。本文中，“起始细胞”和“含有CD4+T淋巴细胞的起始细胞”可互换使用。含有CD4+T淋巴细胞的起始细胞可以有多种来源，例如外周血单个核细胞、脐带血细胞和骨髓细胞等等。 起始细胞也可以是上述来源的细胞经体外扩增所获得的细胞。可以通过任何合适的方法提高起始细胞中CD4+T淋巴细胞的含量。例如，外周血单个核细胞可以使用FicolI-Hypaque (如 GE Healthcare，Cat No. 17_5442_03，密度为1. 077g/ml)密度梯度离心法获得。优选地，起始细胞是从外周血单个核细胞分离的CD4+T淋巴细胞。可以采用免疫磁珠法(如美天旎CD4+磁珠(Cat No. 130-045-101))从外周血单个核细胞分离CD4+T淋巴细胞。在本专利技术的制备方法中，“抗原提呈细胞”包括能够将抗原提呈至⑶4+T淋巴细胞的任何细胞，其可以用本领域技术人员熟知的方法制备。在一个实施方案中，外周血单个核细胞分离出CD4+T淋巴细胞后的剩余细胞用剂量为2000-3000cGy的、射线源照射后作为抗原提呈细胞。在另一个实施方案中，外周血单个核细胞分离出CD4+T淋巴细胞后的剩余细胞用丝裂霉素C处理后作为抗原提呈细胞。在本专利技术的制备方法中，步骤a)中的培养基可以是任何适于培养淋巴细胞的培养基，例如IMDM培养基或IMSF培养基。优选的培养基是IMSF(Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．分离的Ｍｅｌａｎ－Ａ表位肽，其在ＨＬＡ－ＤＰ限制性条件下被ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞特异性识别，所述表位肽由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王歈，英函，焦顺昌，孟昭婷，
申请(专利权)人：北京永泰免疫应用科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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