本发明专利技术公开了一种可靶向运输DNA到神经细胞及脑部的肽，属于生物科学和药物载体领域。所述肽由靶向序列、连接序列和DNA结合序列组成，所述靶向序列为乙酰胆碱受体识别配体，所述DNA结合序列为9聚精氨酸，它的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.1所述。该肽可靶向运输DNA到神经细胞及脑部。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物科学和药物载体领域。
技术介绍
基因治疗是一些脑部疾病最可能的解决手段之一，但是血脑屏障阻止了一些药物分子，包括治疗性基因进入脑内。因此，发展一种能够运输基因跨过血脑屏障到达脑部的载体对于一些脑部疾病的治疗研究来说就十分重要。病毒载体已经被证明可以有效运输基因到神经元以及活体动物的脑内细胞。然而，病毒载体也有一系列的缺点，比如对只能携带较小分子量的基因，构建和使用较为复杂，容易引起炎症反应以及潜在的安全性问题等，这些都会影响其在人体的应用。所以研究者们发展了一系列人工合成的对货物分子尺寸要求更宽松，免疫原性更低，使用更加方便的非病毒载体。在这些非病毒载体中，阳离子脂质体和高聚物由于其使用方便以及在细胞模型中的高效率得到了广泛的使用和研究。然而，他们由于对神经元以及活体动物的脑内细胞的运输效率较低，所以到目前只有极少数利用它们将DNA运输到脑部的成功例子。另外由于它们本身效率以及毒性上的局限，发展新型的能够运输DNA到脑部的非病毒载体仍然非常有必要。细胞穿膜肽是一类能够携带运输一些小分子比如肽，核酸等跨过细胞膜进入细胞的肽，典型的细胞穿膜肽有9聚精氨酸等等。以肽作为DNA运输载体有着一些优势比如生物降解性、生物相容性好，毒性相对更低，也更易于合成等等。但是，到目前为止，还没有利用由肽构成的载体将DNA高效携带进入动物神经元表达的例子，另外由肽构成的载体本身对细胞或者组织没有选择性，不能将DNA靶向性的运输到特定部位，也在很大程度上限值了它在生物治疗研究中的应用。RVG29是一个含四个氨基酸残基的肽，据报道可以特异性的被乙酰胆碱受体高表达的神经细胞识别并吸收，并能够跨过血脑屏障。因此它曾被用来表面修饰阳离子脂质体以及高聚物来实现靶向脑部的基因运输。也有研究者曾用它来构建一段肽实现了将相对较为容易携带的siRNA带入了动物脑部。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述问题而提供了一种可靶向运输DNA到神经细胞及脑部的肽，该肽由乙酰胆碱受体识别配体、连接序列和9聚精氨酸组成，该肽可靶向运输DNA到神经细胞及脑部。本专利技术所采用的技术方案是一种可靶向运输DNA到神经细胞及脑部的肽，它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 1 所述。进一步地，该肽是由靶向序列、连接序列和DNA结合序列组成。进一步地，所述靶向序列为乙酰胆碱受体识别配体。进一步地，所述DNA结合序列为9聚精氨酸。进一步地，所述连接肽的氨基酸序列为GGGG。本专利技术具有以下优点本专利技术的肽将乙酰胆碱受体识别配体与9聚精氨酸通过一段连接序列结合起来，提供了一种新型可靶向运输DNA到神经细胞以及活体动物脑部的肽。该肽包裹质粒DNA进入特定细胞后，质粒DNA能在细胞中稳定表达。在神经细胞系Neuro 2a中，其介导的表达效率明显高于目前市场上最优秀的转染试剂之一 Lipofectamine LTX & Plus，而细胞毒性相对较低。同时该肽与DNA形成的复合物的尺寸也较低，有利于在生物体内发挥作用，同时生物相容性更佳。在活体检测中，该肽能有有效运输质粒DNA透过血脑屏障到达脑部并表达，解决了 DNA难以被运输到脑部并表达的困难。附图说明下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为RVG^_9rR包裹质粒DNA的原理示意图2为不同N/P比的RVG^-9rR包裹质粒DNA进行琼脂糖电泳图； 图3为以不同N/P比混合RVG^-9rR以及质粒DNA形成的混合物颗粒的粒径测量图； 图4为混合物颗粒的kta电位测量图5为RVG^-9rR在不同NP比下包裹pEGFP-Nl进入Neuro 2a细胞以及HeLa细胞并表达的激光共聚焦成像的显示图6为RVG^-9rR在不同NP比下包裹pEGFP-Nl进入Neuro 2a细胞细胞并表达的流式细胞仪检测图7为RVG^-9rR在N/P=3:1条件下包裹pGL_3进入Neuro 2a细胞的表达效率与脂质体以及空白细胞的对照图，“***”代表P<0.001，即两组数据之间有显著性差异；图8为MTT检测RVG^-9rR在N/P=3 1条件下转染质粒DNA进入Neuro加细胞对细胞的毒性与使用脂质体转染的毒性对比，“**”代表P<0. 01，即两组数据之间有显著性差异； 图9为RVG^-9rR在N/P=3:1条件下转染pEGFP-Nl进入大鼠原代脑皮层神经元的荧光显微镜成像图10为RVG^-9rR在N/P=3:1条件下包裹pGL_3，通过尾静脉注射到小鼠体内然后被运输到个组织表达的分布图，“***”代表P<0.001，即两组数据之间有显著性差异。具体实施例方式本专利技术的肽由靶向序列、连接序列和DNA结合序列组成，靶向序列为乙酰胆碱受体识别配体，DNA结合序列为9聚精氨酸，该肽的氨基酸序列为YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGK RASNGGGGGrRrRrRrRr (简称 RVG^_9rR)，其中 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG 为乙酰胆碱受体识别配体，也叫靶向肽RVG29，它起富集到靶向细胞并被其摄取的作用，GGGG为连接序列，起连接以及消除空间位阻作用，rRrRrRrRr为9聚精氨酸，r为非天然型精氨，起到包裹质粒DNA的作用。RVG^_9rR利用9聚精氨酸序列中侧链的阳离子与DNA面的阴离子结合并对其压缩，具体操作方法为将需要运载的质粒DNA按照一定的正负电荷比(N/P比)与RVG^-9rR 在体系中混合20分钟，然后加入细胞培养体系中或者通过尾静脉注射到小鼠体内即可。RVG^-9rR包裹质粒DNA的原理示意图如图1所示。观察RVG^_9rR对质粒DNA的包裹图2为以不同N/P比混合RVG^-9rR以及质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图，可见从N/P比为1:1开始，DNA已经基本完全被结合；图3为以不同N/P比混合RVG^-9rR以及质粒DNA 形成的混合物颗粒的粒径测量图，显示从N/P比约为3以上时，RVG^-9rR和质粒DNA形成的混合颗粒的尺寸已经被压缩稳定在了 80纳米左右；图4为混合物颗粒的kta电位测量图，显示从N/P比约为3以上时，RVG^-9rR和质粒DNA形成的混合颗粒的kta电位已经基本稳定在了 27 mV左右。颗粒粒径以及kta电位测量仪器Malvern Zetasizer0RVG29-9rR转染细胞后激光共聚焦成像从两种细胞(Neuro加和HeLa)接种相同数目(1X104 cells/well)的细胞于Lab-Tek 8孔板。37°C、5% C02环境下培养过夜，使细胞重新贴壁。使用RVG^-9rR按N/P比 1 1，3 1，6 1和12 1混合在正常含血清培养基环境下携带pEGFP-Nl进入细胞，5小时后换上新鲜培养基，48小时后使用激光共聚焦显微镜观察。成像条件所有细胞样品通过共聚焦显微镜FV1000观察。pEGFP-Nl所表达的绿色荧光蛋白由Ar激光器在488 nm处激发，在495-555 nm接受。共聚焦显微镜型号FV1000 (Olympus, Japan)。其孵育细胞后激光共聚焦成像的显示图见附图5，可见RVG^_9rR选择性的转染了 Neuro 2a细胞而且在N/P=3至6视野中有较多的绿色荧光蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种可靶向运输ＤＮＡ到神经细胞及脑部的肽，其特征在于，它的氨基酸序列为序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉慧，骆清铭，龚铖，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83
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