一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明专利技术方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒检测领域，涉及一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，更具体而言涉及。
技术介绍
反转录聚合酶链式反应试剂盒的对照样品在实验中的作用是在每次RT-PCR检测时，设立的阴性对照样品和阳性对照样品是不能缺少的，阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明RNA提取、RNA反转录、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果都成立的前提下，才能对检测样品进行判定。因此，每次试验都应设立RNA提取、RNA反转录、 DNA扩增和电泳鉴定对照，只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。因此，反转录聚合酶链式反应试剂盒要设立阳性对照，试剂盒中阳性对照需要满足以下三点1)稳定性好，2)可靠有效，3)符合生物安全。生物安全是指生物性的传染媒介通过直接感染或间接破坏环境而导致对人类、动物或者植物的真实或者潜在的危险。因此，符合生物安全是指避免了上述危险。所述危险例如是高致病性病原微生物，第一类和第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物，第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。对于一些高致病性病原微生物的反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，目前大多数这种试剂盒做法是将目的片段克隆至载体上，其缺点是不能作为RNA提取、RNA反转录过程对照，且容易污染。因此，亟需一种稳定性好、可靠有效、符合生物安全的反转录聚合酶链式反应试剂盒阳性对照的制备方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性组合物对照，特别是阳性对照组合物及其制备方法，该方法制得的阳性对照稳定性好、安全可靠、可大大减少试验污染的可能性。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的。本专利技术提供了一种反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法，其特征在于，选取一种非靶病毒作为阳性对照模板。本专利技术的一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自比较安全、遗传稳定、容易培养的病毒株。在本专利技术的具体实施方式中，所选取的非靶病毒株鸡新城疫病毒Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。本专利技术的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括使用灭活试剂处理所述非靶病毒的培养液。所述灭活试剂为高浓度强变性剂， 其迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，还使细胞内的RNA酶失活，使释放出的RNA 不被降解。其中，高浓度强变性剂包括但不限于异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍等含有胍基的盐。灭活试剂可用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR阳性对照的灭活。也就是说，在本专利技术所述的方法中将非靶病毒培养液用变性剂进行稀释，稀释的倍数可由本领域技术人员容易地确定，一般应稀释不小于7倍，优选地稀释50-100倍，更优选地稀释50倍。稀释倍数与病毒含量有关，其中阳性对照的要求是病毒含量既不能太高，也不能太低；太高了，容易污染试剂盒，太低了，使试剂盒的保存期较短。根据各自试剂盒的要求进行稀释。本专利技术的还一个方面，反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法中还包括设计一对非靶病毒引物，对所述选取的非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒所针对目的基因的长度相同本专利技术还提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物，其特征在于包括一种非靶病毒作为阳性对照模板。在本专利技术的具体实施方式中，阳性对照组合物中选取的非靶病毒为RNA病毒，其可以是任意的符合生物安全的RNA病毒，包括但不限于鸡新城疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且选自安全、遗传稳定、容易培养的病毒株，优选的所述病毒株包括鸡新城疫病毒Iasota株和猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV株。在本专利技术的一个方面中，阳性对照组合物还包括灭活试剂。灭活试剂为高浓度强变性剂。其中，高浓度强变性剂包括但不限于含有胍基的盐，优选的是异硫氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍。灭活试剂可用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR阳性对照的灭活。所述非靶病毒的培养液用根据病毒含量所述灭活试剂进行稀释，一般应稀释不小于7倍，优选地稀释50-100 倍，更优选地稀释50倍。而稀释倍数可由本领域技术人员根据各自试剂盒的要求容易地确定。在本专利技术的一个方面中，阳性对照组合物还包括一对非靶病毒引物，以对所述非靶病毒进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒针对的目的基因的长度相同。本专利技术还提供了上文所述阳性对照组合物的用途，其用作反转录聚合酶链式反应试剂盒的部分。本专利技术的阳性对照组合物可以置于反转录聚合酶链式反应试剂盒中。在本专利技术的具体实施方式中，所适用的反转录聚合酶链式反应试剂盒包括但不限于禽流感病毒RT-PCR试剂盒和口蹄疫病毒RT-PCR试剂盒，其中禽流感病毒RT-PCR试剂盒可用于禽类，例如鸡、鸭、鹅、麻雀、鸽子等等；口蹄疫病毒RT-PCR试剂盒可用于检测偶蹄动物，例如牛。与现有技术相比，本专利技术方法制备的阳性对照安全、易保存，可以起到RNA提取、 RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中的反转录酶等活性正常，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料易造成病毒扩散的缺点。具体实施例方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。利用检测靶病毒作为阳性对照是一种理想的方法。由于禽流感发生会给国家造成严重的经济损失，且禽流感属于人畜共患病。因此，禽流感病毒检测试剂盒生物安全是非常重要的。特别是禽流感病毒作为阳性对照可能会对实验室环境产生一些不安全的影响。鸡新城疫病毒Iasota株为一株弱毒疫苗株，广泛应用我国鸡新城疫免疫接种，在预防鸡新城疫方面发挥了十分重要的作用。同时该病毒毒株在鸡胚培养中血凝效价很高， 最高可达到2_13，是比较安全、遗传稳定、容易培养的病毒株。因此鸡新城疫病毒Iasota株是设立反转录阳性对照的理想病毒。我们采用鸡新城疫病毒Iasota株作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了 RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明了 RNA提取试剂、反应体系中反转录酶等活性正常。同时设计一对针对鸡新城疫病毒的引物，此引物要求扩增的片段大小恰好与所检测的禽流感病毒扩增片段长度相一致。加入含异硫氰酸胍的灭活试剂， 将鸡新城疫病毒灭活，作为禽流感病毒反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照，由于RNA 提取过程中采用了鸡新城疫病毒Iasota株作为提取对照，大大减少了试验污染的可能性， 比较适合长期进行禽流感检测的实验室或大规模的禽流感监测。附图说明图1.实施例2中阳性对照的扩增结果。其中各个泳道分别是1. Marker 2.阳性对照3.样品4.阴性对照。图2.实施例3中阳性对照的扩增结果。其中各个泳道分别是1. M本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物的制备方法，其特征在于，选取一种非靶病毒作为阳性对照模板。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，陈西钊，乔明明，赵铁柱，田克恭，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11