抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供一种分泌特异性识别非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系和上述细胞系分泌的单克隆抗体，以及检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒及其应用。所述的杂交瘤细胞系4G12是通过杂交瘤技术以真核表达的重组可溶性CD2v蛋白作为免疫原建立的；所述细胞系分泌的单克隆抗体能够识别非洲猪瘟病毒CD2v抗原并被非洲猪瘟病毒阳性血清显著阻断，灵敏度高，特异性强；所述单克隆抗体经过辣根过氧化物酶标记，制备诊断非洲猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒具备灵敏度高、特异性强、批间差异小的特点。

【技术实现步骤摘要】
抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高，可高达100％。临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，在沈阳市沈北新区发生疑似非洲猪瘟疫情。世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视。非洲猪瘟病毒(ASFV)主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。基因组编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。科学家们根据p72和CD2v基因分别进行基因型和血清型分析。而CD2v是非洲猪瘟中蛋白中的主要外膜蛋白，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。非洲猪瘟病毒编码的CD2v蛋白能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞，帮助病毒扩散，并抑制淋巴细胞的功能。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体，在检测非洲猪瘟病毒抗体时具有较高的灵敏度和特异性。本专利技术的第一个方面是提供一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.19947的小鼠杂交瘤细胞系4G12分泌的。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别并结合如SEQIDNO.2所示的抗原表位或非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。进一步地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1，kappa链。第二个方面是提供一株分泌抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系4G12，所述小鼠杂交瘤细胞系4G12已于2020年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.19947。进一步地，所述小鼠杂交瘤细胞系4G12是以SEQIDNO.2所示的抗原表位为免疫原。第三个方面是提供上述的单克隆抗体或小鼠杂交瘤细胞系4G12在如下中的应用：a1.在制备诊断或检测与具有如SEQIDNO.2所示的抗原表位相关的抗原的产品的用途；a2.在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的产品的用途；a3.在制备诊断、检测或预防与非洲猪瘟病毒相关的疾病的产品的用途；a4.在制备诊断或检测与非洲猪瘟病毒抗体相关的产品的用途；优选的，在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的用途；a5.在具有如SEQIDNO.2所示的抗原表位相关的抗原的分离纯化或检测的用途；a6.在非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测的用途；a7.在非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测的用途；所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。第四个方面是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其包括上述的单克隆抗体。第五个方面是一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括：酶标结合板、洗涤液、样品稀释液、底物、终止液、封闭液、酶标记上述的单克隆抗体结合液、标准阴性对照、标准阳性对照和说明书。进一步地，酶标结合板是通过如下方法得到的：用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将纯化后重组CD2v蛋白稀释后，按0.3μg/mL加入微孔板中，每孔100μL。4℃包被过夜，次日弃去包被缓冲液，按200μL/孔加入2％(m/v)酪蛋白的封闭液，4℃封闭过夜，室温干燥后装入真空铝封袋，抽真空封装保存，即得。进一步地，洗涤液(20×)PBST(pH7.4)：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Tween-200.5mL，加蒸馏水至1L。浓缩成20倍作为存储液。进一步地，样品稀释液：BSA1g，酪蛋白2g，加洗涤液(1×)至1L。底物液A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％(v/v)H2O2溶液0.3mL，加蒸馏水至500mL。底物液B：TMB(用水溶)0.15g，甘油50mL，柠檬酸0.95g，乙二胺四乙酸二钠0.2g，加蒸馏水至500mL。终止液(2MH2SO4)：蒸馏水891.5mL，逐滴加入98％(v/v)浓硫酸至1L。酶标记单克隆抗体结合液：用样品稀释液将酶标记单克隆抗体稀释至0.1μg/mL。标准阳性对照：CD2v抗原免疫猪血清，经过OIE推荐INGENASA非洲猪瘟cELISA抗体检测试剂盒，及本专利技术的ELISA试剂盒标定。标准阴性对照：SPF猪血清(使用样品稀释液进行20倍稀释)第六个方面是上述的单克隆抗体或上述的小鼠杂交瘤细胞系或上述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体中的应用；或，上述的单克隆抗体或上述的小鼠杂交瘤细胞系在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用。第七个方面是上述的单克隆抗体经过酶标记在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的应用。第八个方面是一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的方法，是将上述的单克隆抗体经过酶标记后，作为酶标抗体的竞争ELISA检测方法。进一步地，上述方法包括如下步骤：(1)将非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入阳性对照、阴性对照或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入酶标记权利要求1所述的单克隆抗体，孵育，洗涤；(5)向(4)得到的酶标板中加入底物显色显色后加入终止液终止反应；(6)用酶标仪检测各孔的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.19947的小鼠杂交瘤细胞系4G12分泌的。/n

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.19947的小鼠杂交瘤细胞系4G12分泌的。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别并结合如SEQIDNO.2所示的抗原表位或非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。


3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型为IgG1，kappa链。


4.一株小鼠杂交瘤细胞系4G12，其保藏号为CGMCCNo.19947。


5.根据权利要求4所述的小鼠杂交瘤细胞系4G12，其特征在于，所述小鼠杂交瘤细胞系4G12是以SEQIDNO.2所示的抗原表位为免疫原。


6.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或权利要求4或5所述的小鼠杂交瘤细胞系4G12在如下任一项中的用途：
a1.在制备诊断或检测与具有如SEQIDNO.2所示的抗原表位相关的抗原的产品的用途；
a2.在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的产品的用途；
a3.在制备诊断、检测或预防与非洲猪瘟病毒相关的疾病的产品的用途；
a4.在制备诊断或检测与非洲猪瘟病毒抗体相关的产品的用途；优选的，在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的用途；
a5.在具有如SEQIDNO.2所示的抗原表位相关的抗原的分离纯化或检测的用途；
a6.在非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测的用途；
a7.在非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测的用途；
所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。


7.一种检测或辅助检测非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟立超，徐黎晖，陈西钊，王雨佳，周景云，梁臻妮，闫歌，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11