一种狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及狂犬病应用技术领域，具体涉及一种狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途，包括如下(a)‑(c)中的一种：(a)、在N端到C端方向依次包括如氨基酸序列片段N、G以及P；(b)、在(a)中的氨基酸序列片段N、G和/或P经过取代、缺失或添加至少一个或几个氨基酸的狂犬病病毒重组抗原，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应；或(c)、具有与(a)中的狂犬病病毒重组抗原的氨基酸序列同源性的氨基酸序列，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应；上述狂犬病病毒重组抗原具有抗原性好和非特异性小的抗原表位，且相比全毒抗原具有稳定、安全、培养成本低、高效的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途
本专利技术涉及狂犬病应用
，具体涉及一种狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)引起的致死性、高度嗜神经性人兽共患烈性传染病，其遍及世界各地，狂犬病病毒可以引起人和多种动物致死性中枢神经系统感染，狂犬病临床表现主要为恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等，病死率几乎为100％。世界卫生组织2018年6月发布的报告显示，狂犬病每年致5.9万人死亡(近半数是儿童)，亚洲占59.6％，非洲占36.4％，人类狂犬病99％由犬、猫传播。鉴于目前狂犬病还没有有效的治疗方法，故狂犬病主要是通过疫苗免疫防控，而监控免疫动物免疫后体内的抗体水平以及一些流浪犬猫的体内抗体水平尤为重要。狂犬病病毒属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病病毒属(lyssavirus)，呈子弹状。狂犬病病毒可通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，经神经末梢上行进入人及所有温血动物中枢神经系统(CNS)而引发狂犬病。狂犬病病毒基因组核酸为不分节段的单股负链RNA，由11928或11932个核苷酸组成，有5个大的开放阅读框，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和依赖RNA的RNA多聚酶5个结构蛋白。研究表明，核蛋白在各毒株之间有高度保守性，不同株系的核蛋白氨基酸的同源性在98％～99.6％，是病毒中最稳定的蛋白。糖蛋白是狂犬病毒唯一的糖蛋白，正确糖基化决定其蛋白稳定性、抗原性及生物学活性。糖蛋白与病毒的感染和免疫有着密切关系，是唯一诱导机体产生中和抗体的蛋白。故糖蛋白常用中和抗体的检测。磷蛋白占总蛋白的6％，与RNA多聚酶、RNP(核糖核酸蛋白)共同组成核衣壳。当前国际认可检测狂犬病抗体的方法有多种，如：荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、小鼠病毒中和试验(MNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。目前，狂犬病病毒抗体检测试剂盒主要有胶体金和ELISA方法，且抗原多采用核蛋白抗原、糖蛋白抗原或者全毒抗原。虽然全病毒抗原的检测试剂盒检测狂犬病抗体具有特异性较高的优势，但是在全毒抗原制备以及后期纯化过程中工作人员存在很大的感染风险，且制备成本高、获得量少。而单独使用核蛋白抗原或糖蛋白抗原的检测试剂盒检测狂犬病抗体时，则存在漏检、特异性差、方法灵敏度低等不足。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种特异性高、敏感性高、成本低且安全的狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途。为此，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术提供了一种狂犬病病毒重组抗原，包括如下(a)-(c)中的一种：(a)、在N端到C端方向依次包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列片段N、SEQIDNO.2所示的氨基酸序列片段G以及SEQIDNO.3所示的氨基酸序列片段P；(b)、在(a)中的氨基酸序列片段N、氨基酸序列片段G和/或氨基酸序列片段P经过取代、缺失或添加至少一个或几个氨基酸得到的狂犬病病毒重组抗原，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应；或(c)、具有与(a)中的狂犬病病毒重组抗原的氨基酸序列同源性的氨基酸序列，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应。进一步的，相邻的两个氨基酸序列片段之间连接有柔性肽，所述柔性肽的长度为5-15个氨基酸。进一步的，所述柔性肽的氨基酸序列为GGGSSS、GGSGGS或GGGGS。本专利技术提供了编码所述的狂犬病病毒重组抗原的核苷酸序列。本专利技术提供了一种载体，包含所述的核苷酸序列。在所述的载体中，所述载体为质粒载体。进一步的，所述载体可以为pGAPZa质粒或pMD19-T。本专利技术提供了一种宿主，包括所述的载体。进一步的，所述宿主为原核细胞或真核细胞。进一步的，所述宿主为毕赤酵母。本专利技术提供了一种所述的狂犬病病毒重组抗原制备方法，将含有所述的狂犬病病毒重组抗原的核苷酸序列的表达载体转入宿主中，然后进行诱导表达。进一步的，所述诱导表达的步骤为：将所述宿主接种至培养基中，震荡培养，然后将得到的培养液接种到新的培养基中，再次震荡培养，将获得的菌液进行离心，保留上清。优选的，所述诱导表达的步骤为：将所述宿主接种至含有Zeocin的YPD培养基中，于30℃下、250r/min震荡培养，然后将得到的培养液按照体积比1：500接种到YPD培养基中，于30℃下、250r/min震荡培养4天，将获得的菌液进行离心10000g/min，保留上清。进一步的，还包括对诱导表达得到的含有狂犬病病毒重组抗原的溶液采用离子交换方法进行纯化。进一步的，所述纯化步骤包括硫酸铵粗提、层析脱盐、精提层析和透析。进一步的，在硫酸铵粗提步骤中，使用终浓度为40-80％的饱和硫酸铵沉淀，搅拌均匀，充分沉淀后，离心，弃掉上清，保留沉淀。优选的，使用终浓度为60％的饱和硫酸铵沉淀。进一步的，离心条件为14000-16000g/min离心8-12min。优选的，离心条件为15000g/min离心10min。进一步的，在层析脱盐步骤中，包括：将硫酸铵粗提得到的沉淀用缓冲液溶解，离心，取上清，备用；将上清上样于用缓冲液平衡后的层析柱，然后用缓冲液冲洗，收集第一个吸收峰，得到脱盐后的蛋白粗品。进一步的，在层析脱盐步骤中，将上清以8-12ml/min流速通过平衡后的层析柱。优选的，将上清以10ml/min流速通过平衡后的层析柱。进一步的，在层析脱盐步骤中，所述缓冲液为18-22mM/LTris-Hcl，pH7.9-8.1。优选的，所述缓冲液为20mM/LTris-Hcl，pH8.0。进一步的，在层析脱盐步骤中，所述离心条件为11000-13000g/min，离心时间为20min。优选的，所述离心条件为12000g/min，离心时间20min。进一步的，在层析脱盐步骤中，所述层析柱用水冲洗4-6个柱体积，再用所述缓冲液平衡1-3个柱体积。优选的，在层析脱盐步骤中，所述层析柱用水冲洗5个柱体积，再用所述缓冲液平衡2个柱体积。进一步的，在精提层析步骤中，将得到的蛋白粗品稀释后上样于层析柱，用洗脱液洗脱柱子到出峰，收集洗脱峰。进一步的，在精提层析步骤中，蛋白粗品经所述缓冲液稀释，所述缓冲液为18-22mM/LTris-Hcl，pH8.0。优选的，所述缓冲液为20mM/LTris-Hcl，pH8.0。进一步的，在精提层析步骤中，所述洗脱液为含0.18-0.22mol/L氯化钠和18-22mM/LTris-Hcl，pH7.9-8.1。优选的，所述洗脱液为含0.2mol/L氯化钠和20mM/LTris-Hcl，pH8.0。进一步的，在精提层析步骤中，将得到的蛋白粗品稀释后以13-17ml/min通过层析柱。优选的，将得到的蛋白粗品稀释后以15ml/min通过层析柱。进一步的，在透析步骤中，将精提层析中收集的样品用样品保存缓冲液PBS在2-8℃冰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种狂犬病病毒重组抗原，其特征在于，包括如下(a)-(c)中的一种：/n(a)、在N端到C端方向依次包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列片段N、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列片段G以及SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列片段P；/n(b)、在(a)中的氨基酸序列片段N、氨基酸序列片段G和/或氨基酸序列片段P经过取代、缺失或添加至少一个或几个氨基酸得到的狂犬病病毒重组抗原，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应；或/n(c)、具有与(a)中的狂犬病病毒重组抗原的氨基酸序列同源性的氨基酸序列，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应。/n

【技术特征摘要】
1.一种狂犬病病毒重组抗原，其特征在于，包括如下(a)-(c)中的一种：
(a)、在N端到C端方向依次包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列片段N、SEQIDNO.2所示的氨基酸序列片段G以及SEQIDNO.3所示的氨基酸序列片段P；
(b)、在(a)中的氨基酸序列片段N、氨基酸序列片段G和/或氨基酸序列片段P经过取代、缺失或添加至少一个或几个氨基酸得到的狂犬病病毒重组抗原，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应；或
(c)、具有与(a)中的狂犬病病毒重组抗原的氨基酸序列同源性的氨基酸序列，且可诱发哺乳动物针对所述狂犬病病毒重组抗原的免疫反应。


2.根据权利要求1所述的狂犬病病毒重组抗原，其特征在于，相邻的两个氨基酸序列片段之间连接有柔性肽，所述柔性肽的长度为5-15个氨基酸。


3.根据权利要求2所述的狂犬病病毒重组抗原，其特征在于，所述柔性肽的氨基酸序列为GGGSSS、GGSGGS或GGGGS。


4.编码权利要求1-3任一项所述的狂犬病病毒重组抗原的核苷酸序列。


5.一种载体，包含权利要求4所述的核苷酸序列；优选的，还包括一种宿主，包括所述的载体。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘巧荣，陈西钊，马君，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11