本专利涉及一种可以定向杀死肿瘤细胞的融合蛋白突变体，是由促性腺激素释放激素(GnRH)组成的导向部分和由细胞毒素组成的效应部分构成，具有定向到达并杀死过量表达GnRH受体的肿瘤细胞的特性。
【技术实现步骤摘要】
目前治疗癌症的传统方法包括手术、放疗和化疗等，其中运用手术治疗是一种非常直接有效的方法，但实际上会受到病种和病程等多种复杂因素的制约，很多情况下难以实施，放疗和化疗是治疗癌症最常见的方法，但众所周知其副作用非常大，效果却大多不理想，所以医学界试图寻找一种副作用小、药效显著的生物治疗方法来替代放、化疗法，近来导向治疗以惊人的速度和独特的疗效引起了广大从事肿瘤治疗的研究者的广泛关注。本专利技术涉及到一种融合蛋白，以促性腺激素释放激素(&1RH)为导向部分，能够特异性地与过量表达促性腺激素释放激素受体(&1RHR)的肿瘤细胞相结合，以假单胞杆菌外毒素A的缺失体PE40，并且其C末端5个氨基酸突变为Lys-Asp-Asp-Leu，即为PE40KDDL 作为毒性部分，特异性地杀死肿瘤细胞。
技术介绍
1.本项目融合蛋白的导向部分促性腺激素释放激素(&1RH)促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)，又称促黄体激素释方文激素(Luteinizing hormone releasing hormone。LHRH),是一个由 10 个氨基酸组成的多肽激素，主要由下丘脑弓状核分泌细胞产生，调控人体激素水平及生殖功能。此外， 在脑干、杏仁核等下丘脑以外的神经组织中也存在&iRH神经纤维。实际上，&iRH在整个脑区均有分布。研究还发现，松果腺、视网膜、性腺、胎盘、肝脏、消化道及颂下腺等多种器官组织存在&iRH或&iRH样肽。说明这种激素的来源和分布十分广泛。促性腺激素释放激素受体是视紫红质相似的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员， 其在许多人类肿瘤细胞膜表面高密度表达。生殖系统的癌组织，如子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌等癌细胞的细胞膜表面、生殖系统以外的腺癌细胞如黑色素瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、肺癌等的表面都有过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、 发展和浸润等方面发挥了重要作用。2.本项目融合蛋白的毒素部分PE40KDDL假单胞杆菌外毒素A (PEA)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面的PEA受体结合进入细胞，催化延长因子2 (EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白质合成，而导致细胞死亡。PEA 分子由3个部分组成，包括受体结合结构域、转位(跨膜)结构域和活性结构域。为了消除PEA与细胞的非特异性结合，我们将PEA分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端 1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变， 突变为Lys-Asp-Asp-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDDL。3.导向部分与毒素部分的连接通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GnRH)-5肽-毒素部分(PE40KDDL)，融合蛋白序列见SEQ ID NOl。4.本专利技术融合蛋白的特点基于前面所述，促性腺激素释放激素受体在许多人类肿瘤细胞膜表面高密度表达。生殖系统的癌组织，如子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌等癌细胞的细胞膜表面、生殖系统以外的腺癌细胞如黑色素瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、肺癌等的表面都有过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。所以目前有很多报道是针对促性腺激素释放激素受体进行肿瘤治疗的。这些技术在针对肿瘤治疗存在了一定的局限性，比如，促性腺激素释放激素与化疗药相藕联，由于其藕联方式的问题，化疗药容易脱落，造成药物失效，并且化疗药由于不具有选择性，在整体药物到达肿瘤部位之前会侵害正常细胞。通过本专利技术有效地解决了上述缺点，本专利技术是使用&iRH作为导向，PE40KDDL作为毒素部分，能够高效地杀死肿瘤细胞。由于二者是通过5肽肽键进行相连，所以不会有药物脱落的问题；并且毒素部分只有在进入肿瘤细胞后，才能够发挥杀死细胞的作用，而正常细胞表面没有&iRH受体或含量极低，所以其对于正常细胞的毒性非常小，而是特异性杀死肿瘤细胞，并且由于PE40KDDL杀死肿瘤细胞的高效率，作为治疗手段能够控制肿瘤的发展。 本专利专利技术了一类新型导向药物，是选择促性腺激素释放激素以及细胞毒素的小功能片段组成的融合蛋白导向药物，其具有分子量小，用量少和特异性强等特点。三.
技术实现思路
本专利中的药物导向部分包括促性腺激素释放激素(&1RH)，我们将假单胞杆菌外毒素A(PEA)分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了 PE40 分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变，突变为Lys-Asp-Asp-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDDL。通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GnRH)-5肽-毒素部分(PE40KDDL)，融合蛋白序列见SEQ ID NOl。作为本专利技术中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为&1RH和 PE40KDDL组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用对序列表SEQID NOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的变体或其功能性片段。本专利技术的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本专利技术所述的融合蛋白，以及任选的药物上可接受的载体。在本专利技术知，术语“药物上可接受的”意味着制约领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要， 组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。在本专利技术的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的融合蛋白，以及5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。本领域普通技术人员知晓，所述融合蛋白可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本专利技术中，所述融合蛋白是通过基因工程重组表达的方法获得的。实例一重组融合蛋白质粒的构建和工程菌的获得以设计好的SEQ ID NOl氨基酸序列为模板，根据中心法则，选择大肠杆菌偏好的密码子，得到融合蛋白的所对应的核酸序列，再使用全基因合成技术得到上述目的基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种新的基因工程融合蛋白突变体，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，刘存莲，武靖，
申请(专利权)人：北京易德新奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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