快速筛选高效降解农药毒死蜱残留菌株的方法技术

本发明专利技术涉及快速筛选高效降解农药毒死蜱残留菌株的方法。该方法的操作步骤如下：1、以农药毒死蜱为碳源富集高效降解菌株，2、以含农药毒死蜱乳油制剂的选择培养基筛选高效降解菌株，3、复筛降解农药毒死蜱的高效降解菌株，得到高效降解菌株，即台湾嗜铜菌Cupriavidustaiwanensis和微嗜酸寡养单胞菌Stenotrophomonasacidaminiphila。本发明专利技术可以快速筛选24小时内降解100mg/L～300mg/L农药毒死蜱60％以上的高效降解菌株；可以在35天内快速富集降解100mg/L以上高浓度的农药毒死蜱的高效降解菌株；另一方面，降解菌株降解农药毒死蜱后在平板上形成明显的水解透明圈，形成明显的筛选指标，增加筛选的成功率。为治理环境中农药毒死蜱的污染提供合适的菌种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境生物工程
，具体涉及采用直观的水解透明圈作为初筛指标，快速筛选降解环境中农药毒死蜱残留的高效降解菌株。
技术介绍
我国是一个农业大国，农药的生产量和使用量均呈逐年递加之势。农药在农业生产上的大量应用，对于防治农作物病虫害方面起到了极其重要的作用，为粮食丰收提供了可靠的保证。但是长期大量地使用农药使得环境中的农药污染日益严重，危及人们身体健康、食品安全及其他环境问题。有机磷类农药得到长期、广泛、大量的应用，其中农药毒死蜱是世界上使用量最大的农药之一。在我国，农药毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种，生产量和使用量很大。虽然农药毒死蜱是低毒的农药，但是使用量之大、使用范围之广，已对我国大部分地区的土壤、水体造成了严重的污染。存储在土壤、水体中的农药毒死蜱残留不仅对动植物、微生物等生命体产生毒害作用，而且，还直接和间接地影响了人类的健康，所以，需要研发高效清除农药毒死蜱等有机磷残留污染的生态修复技术，为农业安全生产和环境安全提供技术支持和材料。本领域主要存在以下问题。①、已报道的农药毒死蜱降解菌株的降解能力比较低， 大部分菌株只能降解10mg/L 80mg/L的农药毒死蜱；已报道的菌株降解农药毒死蜱的速度很慢，一般需要10天 30天以上的时间才可以降解80%以上的农药毒死蜱。②、在一般研究中采用普通富集培养基进行富集培养，在富集过程中保持培养基的浓度不变，培养基中无机盐的浓度较低，不能真实模拟自然环境条件；在富集过程中添加的农药毒死蜱的浓度也较低，一般只有50mg/L 100mg/L ；富集的时间也较长，可达60天以上；这些情况导致富集效率低，可能漏筛高效菌株。③、在一般微生物学研究中都是采用添加高浓度底物的方式制备选择性培养基，采用稀释平板法筛选降解各类化合物的降解菌株，以平板上出现的水解圈(降解圈)的大小作为指标来判断菌株的降解能力；但农药毒死蜱在水中的溶解度很低，只有lmg/L ；研究人员一般在选择性培养基平板上只添加10mg/L 100mg/L的农药毒死蜱，农药毒死蜱的含量很低，即使目标菌株能够降解毒死蜱，也无法在平板上形成水解圈，研究人员无法依据可靠的指标来挑选目的菌株，只能随机大量挑取平板上长出的菌株， 然后测定这些菌株的降解能力。因此普通的筛选方法具有很大的盲目性，工作效率很低。
技术实现思路
现有筛选农药毒死蜱降解菌株的方法具有很大的盲目性，工作效率很低，为解决存在的这一问题，本专利技术提供一种快速筛选高效降解农药毒死蜱残留的菌株的方法，为农药污染生物修复提供可靠的菌株材料。具体技术解决方案如下快速筛选高效降解农药毒死蜱残留的菌株的方法，其操作步骤如下 1、以农药毒死蜱为碳源富集高效降解菌株取50mL富集培养基，加入含有农药毒死蜱480g/L的农药毒死蜱乳油制剂5. 2 μ L，使富集培养基中的农药毒死蜱净含量为50mg/L，再加入含有农药毒死蜱残留5mg IOmg的污泥5g ；温度30°C、转速120转/分钟条件下，摇床培养21天 35天；每7天加入含有农药毒死蜱480g/L的农药毒死蜱乳油制剂5. 2 μ L和12. 5mL富集培养基，得到降解农药毒死蜱菌株的富集培养物；富集培养基配方硫酸镁0. lg/L、磷酸氢二钾1.0g/L、磷酸二氢钾0. 3g/L、蛋白胨 1.0g/L、水 lL，pH 调至 7. 0 7· 2，121°C灭菌 20 分钟；2、以含农药毒死蜱乳油制剂的选择培养基筛选高效降解菌株2. 1、高效降解菌株选择性培养基的制备在IL富集培养基中加入琼脂粉12g，温度121°C灭菌20分钟；冷却至50°C时，取20mL 加入琼脂粉的富集培养基至平板，在平板中加入含有农药毒死蜱480g/L的农药毒死蜱乳油制剂4. 2 μ L 12. 6μ ,使平板培养基中农药毒死蜱的含量为100 mg/L 300 mg/L,制得选择性培养基平板；2.2、初筛过程采用十倍稀释法稀释降解农药毒死蜱菌株的富集培养物，得到八种浓度的稀释液，八种稀释液的稀释度分别为=IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7UO-8 ；取八种稀释度的稀释液各100 μ L，分别涂在选择性培养基平板上，温度30°C 37°C，倒置培养2 3天；挑选选择性培养基平板上周围出现透明水解圈的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化，然后接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，得到20株以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株；3、复筛降解农药毒死蜱的高效降解菌株对得到20株以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株按照下列步骤分别进行操作3. 1、制备菌液从牛肉膏蛋白胨培养基斜面上挑取一环降解农药毒死蜱的初筛菌株接种于盛有30mL 牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，在温度30°C、转速120转/分钟条件下，摇床培养M小时， 即制得初筛菌株菌液；3. 2、测定初筛菌株降解农药毒死蜱的降解率农药毒死蜱石油醚溶液的制备取农药毒死蜱含量95%的农药毒死蜱，用石油醚稀释， 得到农药毒死蜱含量为5 mg/mL的农药毒死蜱石油醚溶液；取20mL的比色管2支；每支比色管内加入浓度5mg/mL的农药毒死蜱石油醚溶液 0. ImL 0. 2mL，用氮吹仪吹干，向每只比色管中加入所述富集培养基4. 5 mL ；在第1支比色管中加入初筛菌株菌液0. 5mL，在第2支比色管加入富集培养基0. 5mL ；第2支比色管为对照组；将2支比色管均在温度30°C、转速120转/分钟条件下，摇床避光培养M小时，制得初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和对照组样品；3. 3、用石油醚萃取残留的农药毒死蜱向初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和对照组样品中分别加入石油醚5mL，涡旋振荡2 分钟，静置5分钟；待初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至IOmL容量瓶中，用石油醚将滤液定容至10 mL，制得降解后农药毒死蜱残留样品；待对照组样品和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至IOmL容量瓶中，用石油醚将滤液定容至10 mL，制得对照组残留样品；3. 4、检测采用气相色谱法测定降解后农药毒死蜱残留样品和对照组残留样品中农药毒死蜱的含量，以复筛高效菌株；气相色谱工作条件用氮气作载气，流速27 mL ^irT1,柱流量4. 00 mL ^mirT1 ；进样口 SPL，分流比1 :5，进样体积1 μ L ；色谱柱=Agilent DB-5毛细色谱柱，内径0. 23 mm、长度 30 m、膜厚0.25 μ m;使用E⑶检测器；进样口、色谱柱、检测器的温度分别为MO 210 "C >280 "C ；计算初筛菌株降解农药毒死蜱的降解率R权利要求1.，其特征在于 1. 1、以农药毒死蜱为碳源富集高效降解菌株取50mL富集培养基，加入含有农药毒死蜱480g/L的农药毒死蜱乳油制剂5. 2 μ L，使富集培养基中的农药毒死蜱净含量为50mg/L，再加入含有农药毒死蜱残留5mg IOmg的污泥5g ；温度30°C、转速120转/分钟条件下，摇床培养21天 35天；每7天加入含有农药毒死蜱480g/L的农药毒死蜱乳油制剂5. 2 μ L和12. 5mL富集培养基，得到降解农药毒死蜱菌株的富集培养物；1. 2、以含农本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　快速筛选高效降解农药毒死蜱残留菌株的方法，其特征在于：１．１、以农药毒死蜱为碳源富集高效降解菌株取５０ｍＬ富集培养基，加入含有农药毒死蜱４８０ｇ／Ｌ的农药毒死蜱乳油制剂５．２μＬ，使富集培养基中的农药毒死蜱净含量为５０ｍｇ／Ｌ，再加入含有农药毒死蜱残留５ｍｇ～１０ｍｇ的污泥５ｇ；温度３０℃、转速１２０转／分钟条件下，摇床培养２１天～３５天；每７天加入含有农药毒死蜱４８０ｇ／Ｌ的农药毒死蜱乳油制剂５．２μＬ和１２．５ｍＬ富集培养基，得到降解农药毒死蜱菌株的富集培养物；１．２、以含农药毒死蜱乳油制剂的选择培养基筛选高效降解菌株１．２．１、高效降解菌株选择性培养基的制备在１Ｌ富集培养基中加入琼脂粉１２ｇ，温度１２１℃灭菌２０分钟；冷却至５０℃时，取２０ｍＬ加入琼脂粉的富集培养基至平板，在平板中加入含有农药毒死蜱４８０ｇ／Ｌ的农药毒死蜱乳油制剂４．２μＬ～１２．６μＬ，使平板培养基中农药毒死蜱的含量为１００　ｍｇ／Ｌ～３００　ｍｇ／Ｌ，制得选择性培养基平板；１．２．２、初筛过程采用十倍稀释法稀释降解农药毒死蜱菌株的富集培养物，得到八种浓度的稀释液，八种稀释液的稀释度分别为：１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８；取八种稀释度的稀释液各１００　μＬ，分别涂在选择性培养基平板上，温度３０℃～３７℃，倒置培养２～３天；挑选选择性培养基平板上周围出现透明水解圈的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化，然后接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，得到２０株以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株；１．３、复筛降解农药毒死蜱的高效降解菌株对得到２０株以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株按照下列步骤分别进行操作：１．３．１、制备菌液从牛肉膏蛋白胨培养基斜面上挑取一环降解农药毒死蜱的初筛菌株接种于盛有３０ｍＬ牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，在温度３０℃、转速１２０转／分钟条件下，摇床培养２４小时，即制得初筛菌株菌液；１．３．２、测定初筛菌株降解农药毒死蜱的降解率农药毒死蜱石油醚溶液的制备：取农药毒死蜱含量９５％的农药毒死蜱，用石油醚稀释，得到农药毒死蜱含量为５　ｍｇ／ｍＬ的农药毒死蜱石油醚溶液；取２０ｍＬ的比色管２支；每支比色管内加入浓度５ｍｇ／ｍＬ的农药毒死蜱石油醚溶液０．１ｍＬ～０．２ｍＬ，用氮吹仪吹干，向每只比色管中加入所述富集培养基４．５　ｍＬ；在第１支比色管中加入初筛菌株菌液０．５ｍＬ，在第２支比色管加入富集培养基０．５ｍＬ；第２支比色管为对照组；将２支比色管均在温度３０℃、转速１２０转／分钟条件下，摇床避光培养２４小时，制得初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和对照组样品；１．３．３、用石油醚萃取残留的农药毒死蜱向初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和对照组样品中分别加入石油醚５ｍＬ，涡旋振荡２分钟，静置５分钟；待初筛菌株降解农药毒死蜱的样品和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至１０ｍＬ容量瓶中，用石油醚将滤液定容至１０　ｍＬ，制得降解后农药毒死蜱残留样品；待对照组样品和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至１０ｍＬ容量瓶中，用石油醚将滤液定容至１０　ｍＬ，制得对照组残留样品；１．３．４、检测采用气相色谱法测定降解后农药毒死蜱残留样品和对照组残留样品中农药毒死蜱的含量，以复筛高效菌株；气相色谱工作条件：用氮气作载气，流速：２７　ｍＬ·ｍｉｎ－１，柱流量４．００　ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样口ＳＰＬ，分流比１：５，进样体积１　μＬ；色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ　ＤＢ－５毛细色谱柱，内径０．２３　ｍｍ、长度３０　ｍ、膜厚０．２５　μｍ；使用ＥＣＤ检测器；进样口、色谱柱、检测器的温度分别为２４０　℃、２１０　℃、２８０　℃；计算初筛菌株降解农药毒死蜱的降解率Ｒ：式中，Ｒ为初筛菌株降解农药毒死蜱的降解率；Ｃ为降解后农药毒死蜱残留样品中的农药毒死蜱的残留量；Ｃｃｋ为对照组残留样品的农药毒死蜱残留量；得到２０个以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株对农药毒死蜱的降解率，比较２０株以上的降解农药毒死蜱的初筛菌株对农药毒死蜱的降解率，降解率大于６０％的初筛菌株即为筛选出的降解农药毒死蜱残留的高效降解菌株；经以上方法获得两株降解农药毒死蜱残留的高效降解菌株，即Ｘ１菌株和Ｇ１菌株，经鉴定Ｘ１菌株为台湾嗜铜菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ，Ｇ１菌株为微嗜酸寡养单胞菌Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄａｍｉｎｉｐｈｉｌａ。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐欣昀，花日茂，王道胜，张君，高婷婷，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34