一种毒死蜱降解菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种降解毒死蜱的埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｓｐ．）ＣＰＳ，其保藏号为ＣＣＴＣＣ　Ｍ　２０８０９４。本发明专利技术毒死蜱降解菌可快速、高效地降解水体、土壤和蔬菜中的残留毒死蜱，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，生产成本低廉，使用也非常方便，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌，尤其涉及一种毒死蜱降解菌及其应用。
技术介绍
毒死蜱(Chlorpyrifos),英文名dursban或lorsban,商品名乐斯本、 蚁定清、新农宝，化学名称为0，0-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡咬基)硫逐磷 酸酯，是美国陶氏化学公司(Dow Chemical Co.)于1965年开发并研制出 来的一种高效、广谱、中等毒性的有机磷杀虫、杀螨剂，并获得专利(US 3244586)。它具有触杀、胃毒和熏蒸作用，广泛用于防治水稻、麦类、玉 米、棉花、甘蔗、茶叶、果树、花卉和牧畜等方面的螟虫、巻叶虫、粘虫、 介壳虫、坊虫、叶蝉和害螨等百余种害虫。由于毒死蜱大量频繁使用和它的持久性，在水体、土壤、底泥和植物 等环境样品中大量检出毒死蜱残留。美国环保署(USEPA)也报道大范围 的生态系统遭受毒死蜱残留污染。毒死蜱属中等毒性杀虫剂，不仅对土壤 微生物量、微生物种群、微生物呼吸作用、土壤微生物功能多样性、土壤 酶活性、氮循环和固定化等微生物特性有一定的影响，而且能通过食物链 的富集对人体产生潜在的威胁，它能抑制人体胆碱酯酶活性，蓄积于神经 系统后导致恶心、头暈、甚至神志不清，高浓度暴露可造成呼吸麻痹和死 亡。当前，农产品安全问题日益突出，毒死蜱残留已成为我国粮食、蔬菜和茶叶等主要出口创汇农产品中主要;f企测项目。许多国家对农产品，特别 是蔬菜上的毒死蜱残留量进行了严格的规定，如日本规定大米、麦类等粮食作物上最高残留限量为0.1 mg/kg、甘蓝和白菜为1 mg/kg、西红柿和甜 菜为0.05mg/kg、其它蔬菜上的最高残留限量一般为0.01 mg/kg;国际食 品法典委员会规定毒死蜱在蔬菜中的最大残留限量为0.05mg/kg;而我国 规定毒死蜱在叶菜类蔬菜中最大残留限量为lmg/kg,明显高于国际标准， 国外的质量标准对我国出口的农产品构成严重的绿色技术壁垒。因此，如高效安全的去除环境中毒死蜱残留获得了政府部门和7>众的广泛关注 也是当前研究的热点。毒死蜱在水中溶解度低(仅为1.2mg/kg),不易水解，在水体中较穩 定。毒死蜱在土壤中也有较长的持久性，其消解半衰期最长可达1百多夭。 大量研究表明在生态系统中毒死蜱残留的去除主要是由微生物的降解所 致。因此，分离筛选毒死蜱降解菌对于治理毒死蜱的环境污染具有重要的 现实意义，利用降解菌剂去除环境中毒死蜱残留是一种高效安全的方法， 生产和使用成本较低。
技术实现思路
本专利技术提供了 一种降解效率高、速度快的的毒死蜱降解菌。一种毒死蜱降解菌，经鉴定命名为埃希氏菌(Esc/zm'c/^sp.) CPS, 保藏在位于湖北省武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC )，保藏日期为2008年6月20日，保藏号为CCTCC M 208094。该菌抹主要生物学特征为革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，无鞭毛， 无芽孢，大小约为(0.5 pm 1.0 |im) x ( 2.0 ~ 4.0 pm ),菌落粗糙， 在生理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用环糊精、糊糸「、 淀粉、吐温40、吐温80、葡萄糖、乙酸盐，不能利用柠檬酸盐。该菌株 16S rDNA的Genbank登陆号为EU770569。一种含有上述毒死蜱降解菌的菌剂，该菌剂可通过将上述毒死蜱降醉 菌与常规的附加剂混合后制成水剂得到。上述毒死蜱降解菌剂以适当剂量通过直接投加的方式应用于水体中 或通过兑水喷雾的方式应用于土壤和蔬菜上，可安全有效去除水体、土泉 和蔬菜中残留的毒死蜱。本专利技术毒死蜱降解菌可快速、高效地降解水体、土壤和蔬菜中的残留 毒死蜱，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，生产成本低廉，使用也非常方 便，具有广阔的应用前景。附困说明附图说明图1为本专利技术毒死蜱降解菌的电镜图2为毒死蜱标准样品、空白样品和添加样品的色语图3为本专利技术毒死蜱降解菌在纯培养条件下对不同浓度毒死蜱的降解 曲线。具体实施方式 培养基无机盐培养基MgS04.7H2O 0.4 g、 FeS04.7H2O 0.02 g、 K2HP04 0.2 g、 (NH4)2S04 0.2 g、 CaSO40.08g、蒸馏水补足1000mL,混合后搅拌均匀， 调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌(121。C， 20min)后制得。肉汤培养基牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水补足 至1000mL,混合后搅拌均匀，调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌(121。C， 20 min )后制得。牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化钠5.0g、 琼脂20.0g、蒸馏水1000mL,调节pH值至7.0,高压蒸汽灭菌(121。C, 20 min )后制得。菌林分离纯化污染土壤样品采自浙江大学华家池校区农场，取l g 土壤置于100 mL 三角瓶中，加入20mL无机盐培养基，添加毒死蜱浓度至50mg/L,黑暗 振荡培养(30 °C、 160rpm) l周，取上层浊液一环接种于含50 mg/L毒 死蜱的无机盐培养基中，黑暗振荡培养(30 。C、 160rpm) l周，重复上 述培养过程2次(培养基中毒死蜱的浓度分别为100mg/L和200mg/L), 每次培养的接种物均取自上次培养所得的培养液。蘸取少量最后一次培养获得的培养液，在含IOO mg/L毒死蜱的牛肉 膏蛋白胨平板上进行划线分离，于生化培养箱(30 °C)中培养，待平板 上出现单菌落后，挑取单菌落转接至牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上，连 续接种，传代5次，挑取仍能在含有毒死蜱的培养基上生长的菌林，接种 保藏于牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上。菌林鉴定将上述挑取的菌抹进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌抹的电镜照 片如图1所示。该菌株主要生物学特征为革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，无鞭毛，无芽胞，大小约为(0.5 (im~ 1.0 (im)x(2.0 ,~4.0 fim)，菌 落粗糙、在生理盐水中不易分散，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用环糊 精、糊精、淀粉、吐温40、吐温80、葡萄糖、乙酸盐，不能利用柠檬酸 盐。该菌最适生长条件为pH值7.0，温度30 。C，能以毒死蜱作为唯一碳 源和能源生长。该菌林经16SrDNA序列分析鉴定为埃希氏菌属的一个未 知种，命名为埃希氏菌(Esc/zen'c/^ Sp.) CPS 。菌剂制备1. 将保藏在试管斜面上的菌种接种于20 mL无机盐培养基中活化培养7天。2. 将活化好的菌种接种于200 mL含10 mg/L毒死蜱的肉汤培养基中， 振荡培养至对数生长期。3. 将上述对数生长期的菌种离心(8000xg) 10min,倒掉上清液，菌 体分别用30mLpH7,0的0.2 mol/L磷酸緩沖液洗涤3次。4. 将步骤(3 )得到的菌种悬浮于pH 7.0的磷酸緩冲液中，制成OD415 为2.0的菌悬液，即为菌剂。pH 7.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液配方为取0.2 mol/L磷酸氬二钠61 mL 和0.2 mol/L磷酸二氬钠39 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，高压蒸汽灭菌 (121 。C, 20min)后制得。无机盐培养基中毒死蜱的检测将20 mL含毒死埤的无机盐培养液转入250 mL分液漏斗中，分别用 50 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解毒死蜱的埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｓｐ．）ＣＰＳ，其保藏号为ＣＣＴＣＣ　Ｍ　２０８０９４。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方华，虞云龙，王秀国，楚小强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]