口杯法便捷外植体灭菌的方法技术

本发明专利技术提供的是一种简便的用氯气对外植体灭菌的方法。操作步骤是将有干燥外表皮包裹的外植体放在普通口杯的网兜中，口杯中先后倒入次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液产生氯气时，外植体便处在氯气环境中进行灭菌且与次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液是分隔开的，灭菌适当时间后就得到无菌的外植体。该方法的优势为：相比用次氯酸钠或升汞等直接浸泡灭菌，该方法对外植体的伤害更小、灭菌更彻底；相比将氯气和外植体放入干燥器中灭菌，该方法操作更简便，避免了灭菌后的外植体从干燥器中拿到超净台时染菌。用该方法对外植体灭菌的整个过程只需普通口杯、次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液，数小时后就可以达到理想的灭菌效果，操作简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种，该方法操作简便、灭菌彻底、染菌率低并且对外植体的伤害较小。
技术介绍
用于植物组织培养操作的外植体大都是田间或室内培养的作物的一部分，这些外植体的表面常常会不同程度的附着微生物，而这些微生物如果在组织培养操作过程中进入培养基中就会造成培养基污染。所以一般的外植体都不能直接进行组织培养操作，必须先进行严格的灭菌操作，无菌外植体才能进行后续的组织培养操作。外植体灭菌的目的既要彻底杀死材料表面的全部微生物，又要尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。在此基础上，操作要简便不繁琐，以免增加染菌的几率。因此，在植物组织培养中，要根据不同的外植体材料，选用适当的杀菌剂、合适的浓度和处理时间，灵活掌握。常用的外植体杀菌剂有(1)乙醇，乙醇具有脱水作用和溶脂性，它能使蛋白质脱水、变性、沉淀及质膜破损，使微生物致死，是一种常用的外植体表面杀菌剂。乙醇灭菌时间不宜过长，约30s即可杀死外植体表面的绝大部分微生物，延长灭菌时间会增加外植体损伤程度。(2)次氯酸盐，一种强氧化剂，因为在水中形成次氯酸，次氯酸分解后形成盐酸和新生态氧，因此具有杀菌效果。( 升汞，Hg2+与带负电的蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。HgCl2是剧毒药品，经过其灭菌的外植体需彻底除去残留的Hg2+，以消除残留升汞对外植体的伤害。此外，还经常用新洁尔灭、抗生素类等作为杀菌剂。然而，用上述这些方法对外植体灭菌会对外植体产生很大的伤害，尤其是用升汞灭菌外植体，不仅对外植体会有伤害， 如果在操作过程中不小心可能对操作人员身体也有一定的伤害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，针对有干燥种皮或坚硬外壳包裹的外植体提出的一种节约成本、操作便捷、对外植体伤害小、灭菌较彻底的灭菌和手套的污染率，间接的提高了外植体的生长率，提高了经济效益。本专利技术提供的包括的步骤如下1)将需要灭菌的有干燥外表皮包裹的外植体放入口杯匹配的网兜中，再放入盛有次氯酸钠溶液和盐酸溶液的口杯中密闭；2)把口杯放到底部盛有水或碱性液体(用以吸收外漏的氯气)的密闭的大容器内密闭；3)放置2-8小时后把口杯拿到灭菌的超净台中，打开口杯盖，戴上无菌手套把网兜取出，把灭好菌的外植体倒入事先准备好的容器中，就得到了无菌的外植体。本专利技术提供了一种，不采用传统的灭菌方法，对于外表有干燥的种皮或者其他组织包被的外植体，比如用70-75%的酒精浸泡灭菌、用20%的次氯酸钠浸泡灭菌或者用升汞灭菌等方法，而是确保外植体表面干燥后，把外植体放入口杯的网兜中，如果外植体很小，可以先把外植体用透气的材料包裹再放入网兜中，然后在口杯中分别加入次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液，反应生成氯气，迅速把网兜放入口杯中使外植体处于氯气中，放置适当时间后在超净台中取出外植体，这样就得到了无菌的外植体。针对有干燥种皮或坚硬外壳包裹的外植体提出的一种节约成本、操作便捷、对外植体伤害小、 灭菌较彻底的灭菌和手套的污染率，间接的提高了外植体的生长率，提高了经济效益。附图说明图1是实施例1使用的设备示意图。图2是是实施例2使用的设备示意图。图3是网兜放进口杯并盖好口杯操作状态示意图。图4是本专利技术操作状态图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术详细描述具体的操作步骤如下1、准备300ML的口杯(带网兜)、量筒、移液枪、小三角瓶、一次性PE手套、次氯酸钠溶液、浓盐酸溶液、口罩。2、在口杯中倒入20ML质量浓度百分数为20%的次氯酸钠，在小三角瓶中加入2ML 浓盐酸，或者按次氯酸钠浓盐酸=10 1的比例(体积比)准备，把需要灭菌的有干燥外表皮包裹的外植体放在网兜内备用。外植体较小时，可先用透气材料，如滤纸等包好再放进网兜。3、戴上口罩和手套在通风的地方将小三角瓶中的浓盐酸迅速的倒入口杯中，把网兜放进口杯并盖好口杯，然后把口杯放到底部盛有水或碱性液体(用以吸收外漏的氯气) 的带盖的密闭大容器内，然后盖好容器。4、放置适当的时间后把口杯拿到灭菌的超净台中，打开口杯盖，戴上无菌手套把网兜取出，把灭好菌的外植体倒入事先准备好的容器中，就得到了无菌的外植体。 5、迅速把口杯放回到容器中并盖好盖子。6、把口杯放在一个带盖子的大容器中，容器底部放适量的水或碱性液体，以吸收外漏的氯气。2-8小时后，可得到无菌的外植体。实施例1挑取种皮完整、无病斑且干燥的大豆种子(图1，大豆颗粒大，可直接放入网兜)， 将其倒入与口杯配套的网兜中，然后准备好所需的口杯、三角瓶、口罩、手套、20%的次氯酸钠溶液、浓盐酸溶液。在通风的地方，将2ML的浓盐酸加入盛有20ML的次氯酸钠水溶液的口杯中，迅速把盛有大豆种子的网兜放入口杯并盖好盖子，再把口杯放进盛水的大容器中， 最后把容器盖好。动作要快，以免太多氯气泄漏到环境中。5小时后在无菌的超净台中取出大豆，放在无菌的容器中，这样就得到无菌的大豆种子，并且种子的发芽率很高。灭完菌的大豆种子在密封的无菌容器中放置2周再进行组织培养操作仍可保持无菌状态。设定灭菌时间的梯度为ai，3h，4h，5h，Mi，7h，ai七个梯度，每次灭菌大豆种子100粒，分不同批次进行。灭菌后将大豆种子接种于发芽培养基(MSB5+aiig/L 6-BA+15g/L蔗糖 +8g/L琼脂，pH5. 6)，五天后测定污染率(污染的外植体数占总外植体数的百分数)和发芽率(发芽的外植体数占总外植体数的百分数)如下表1 权利要求1.一种，其特征在于包括的步骤1)将需要灭菌的有干燥外表皮包裹的外植体放入口杯匹配的网兜中，再放入盛有次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液的口杯中密闭；2)把口杯放到底部盛有水或碱性液体的密闭的大容器内密闭；3)放置2-8小时后把口杯拿到灭菌的超净台中，打开口杯盖，戴上无菌手套把网兜取出，把灭好菌的外植体倒入事先准备好的容器中，就得到了无菌的外植体。2.如权利要求1所述的外植体灭菌的方法，其特征在于所述的次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为20% 3.如权利要求2所述的外植体灭菌的方法，其特征在于所述的20%的次氯酸钠浓盐酸=10 1，体积。全文摘要本专利技术提供的是一种简便的用氯气对外植体灭菌的方法。操作步骤是将有干燥外表皮包裹的外植体放在普通口杯的网兜中，口杯中先后倒入次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液产生氯气时，外植体便处在氯气环境中进行灭菌且与次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液是分隔开的，灭菌适当时间后就得到无菌的外植体。该方法的优势为相比用次氯酸钠或升汞等直接浸泡灭菌，该方法对外植体的伤害更小、灭菌更彻底；相比将氯气和外植体放入干燥器中灭菌，该方法操作更简便，避免了灭菌后的外植体从干燥器中拿到超净台时染菌。用该方法对外植体灭菌的整个过程只需普通口杯、次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液，数小时后就可以达到理想的灭菌效果，操作简便。文档编号A01H4/00GK102293155SQ201110202739公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日专利技术者关春峰, 季静, 王罡, 郑丽红 申请人:天津大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种口杯法便捷外植体灭菌的方法，其特征在于包括的步骤：１）将需要灭菌的有干燥外表皮包裹的外植体放入口杯匹配的网兜中，再放入盛有次氯酸钠溶液和浓盐酸溶液的口杯中密闭；２）把口杯放到底部盛有水或碱性液体的密闭的大容器内密闭；３）放置２－８小时后把口杯拿到灭菌的超净台中，打开口杯盖，戴上无菌手套把网兜取出，把灭好菌的外植体倒入事先准备好的容器中，就得到了无菌的外植体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王罡，季静，郑丽红，关春峰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12