一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，该方法包括：取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取雄蕊，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；将小鳞茎从愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。本发明专利技术以雄蕊为外植体，通过消毒处理、诱导愈伤、小鳞茎再生和增殖以及小鳞茎膨大和生根培养，获得蓝晶花小鳞茎再生体系；显著降低了污染率，提高了诱导率和增殖效率，缩短了扩繁周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物快速繁殖
，尤其涉及一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法。
技术介绍
蓝晶花(Griffinia)为石蒜科(Amaryllidaceae)蓝晶花属，是原产于巴西的热带球根花卉；多生长于植被茂密、潮湿的热带雨林，直径2-3cm，为微型球根植物。自然生长条件下，蓝晶花一般通过分球法分生出侧生小鳞茎而形成新植株。该属植物无法自交，通过种子繁殖需要有两个不同的个体，并且种子成熟要历经长达8个月的时间。因此，营养生长期长、自然繁殖系数低成为了制约蓝晶花属植物扩繁的两个重要因素。此外，由于原生地森林面积的日益缩减，作为濒危物种的蓝晶花在其原生地已面临灭绝的威胁。因此，通过人工方法建立高效的蓝晶花组培扩繁体系显得尤为重要。目前，国内外已有关于石蒜科植物的再生体系建立方法的研究，例如：申请公布号为CN105379618A的专利技术专利申请文献公开了一种石蒜离体快速繁殖方法，该方法包括如下步骤：取露地种植的石蒜种球，消毒，将母球附近附生的子球取下种植1～2个月；将种球消毒后去掉外麟皮，剥取种芽，进行不定芽的诱导生长培养，获得带有不定芽丛的组织块；将得到的组织块制成纵分组织块，在芽伸长培养基上进行芽伸长培养；得到的不定芽伸长产生侧芽时，进行切分后放入生根培养基中进行诱导生根培养，获得石蒜幼苗。该专利技术以石蒜的幼嫩小芽为外植体，直接再生大量不定芽，继而得到再生苗，再生效率增高，出芽率为90％以上，污染率降低，培养过程中不会出现反复污染的情况，通过调节培养基条件可提高诱导率并缩短再生周期。申请公布号为CN102217540A的专利技术专利申请文献公开了一种中国石蒜的快速繁殖方法，该方法包括：取中国石蒜的种胚，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织；将愈伤组织转接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培养基上诱导不定芽；将不定芽转接于含有蔗糖、NAA和6-BA的MS培养基上诱导小鳞茎；将已展叶的小鳞茎转接于含琼脂和NAA的MS培养基上，光照下诱导生根；将已生根的鳞茎移栽于珍珠岩+腐殖质的移栽基质培养。该专利技术以中国石蒜的种胚为外植体，先诱导外植体产生愈伤组织，进而诱导不定芽、小鳞茎的发生，最终完成植株再生，为中国石蒜组织培养快速繁殖增添了又一条新途径。该方法不但增殖系数高，一年可生产百万个小鳞茎，能够为快速繁殖种球提供有效途径；而且试管苗分化同步程度高、一致性好，规模化生产开发价值高，具有很好的经济前景。申请公布号为CN1596600A的专利技术专利申请文献公开了一种长筒石蒜繁殖方法，该方法以长筒石蒜带茎盘鳞片为外植体，采用“两步法”，即先诱导不定芽，进而诱导小鳞茎的发生。以MS为基本培养基，附加不同种类和浓度的植物生长调节物质诱导小鳞茎。通过该方法小鳞茎(芽)每20天增殖率可达480％，一年可生产百万个小鳞茎。申请公布号为CN105475143A的专利技术专利申请文献公开了一种长筒石蒜组织培养得到再生植株的方法，该方法主要包括以下步骤：步骤1、以长筒石蒜的种子胚或花朵为材料诱导出愈伤组织；步骤2、将愈伤组织顺次进行不定芽诱导培养以及生根诱导培养，即得到长筒石蒜再生植株。该专利技术利用石蒜种子胚或花朵为外植体诱导愈伤组织获得完整植株，不仅使石蒜的外植体来源更为广泛易得，而且诱导成功率大幅度提高，诱导成功率达到80％以上，相对于传统的利用石蒜鳞茎为外植体进行诱导的方法提高至少30％，从根本上解决了石蒜的快速繁殖的技术问题。此外，通过该种方法诱导培养所得植株也更为健壮，成活率高，生长速度快。然而，目前尚无关于蓝晶花扩繁体系建立的报道。因此，有必要探究一种更适合于蓝晶花扩繁体系建立的再生体系建立方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，该方法可显著提高蓝晶花小鳞茎的诱导率，有效缩短蓝晶花的育种周期。一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，包括以下步骤：(1)取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取雄蕊，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；(2)将小鳞茎从步骤(1)所述愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；(3)取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。关于石蒜属植物扩繁体系的建立已有相关报道，但是两者(石蒜属、蓝晶花属)虽为同科(石蒜科)而形态、生理、生长发育等属性相差较大，所以在组培扩繁体系的建立方法上也存在着较大的差异。石蒜属植物的鳞茎直径达6-7cm，而蓝晶花属植物的鳞茎直径仅2-3cm，不适合选取娇小的鳞茎为外植体；石蒜属植物易结实，可以选用种子胚；但蓝晶花属植物结实率较低，不适合选用种子、种子胚作为外植体；石蒜属植物一年仅开花一次，且一球仅抽生一个花序，花期较短，而多数蓝晶花属植物一年可多次开花，一球可抽生1-2个花序；因此，蓝晶花属植物花器官易得，本专利技术将花器官作为组培外植体的来源。开花前一周含苞期的花苞因花被片未打开，外植体不易受到污染，且花器官幼嫩，诱导力强；作为优选，所述蓝晶花花蕾为处于含苞期且长1.5～2.5cm的花苞。在消毒处理前，将蓝晶花花蕾(即外植体)进行冷藏可有效减少花蕾表面细菌的污染，有利于降低花苞外植体的污染率。具体地，所述消毒处理的过程，包括：将所述蓝晶花花蕾置于4℃下冷藏1周后，用表面活性剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后，再用消毒试剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后，得到已消毒的蓝晶花花蕾。其中，所述表面活性剂为吐温和/或洗洁精，浸泡时间为15～20min。所述消毒试剂为体积分数75％的乙醇以及质量体积比为0.1％的升汞；外植体先在乙醇中浸泡30s，再在升汞中浸泡8～10min；最后用无菌水漂洗3～5遍，直至无明显泡沫。清洗时，采用纱布包裹蓝晶花花蕾可避免因流水直接冲击幼嫩花蕾而造成的花蕾损伤。由于蓝晶花花器官个体小，组织材料薄，在湿润的情况下接种，雄蕊易粘连在一起，不利于外植体与培养基的接触，且容易造成污染；所以，接种前需将消毒处理后的蓝晶花花蕾表面水分吸干。切取雄蕊时，要注意保留雄蕊与子房连接处的组织；因为据试验观察，不包含此部分的雄蕊外植体在诱导培养基上无法诱导出愈伤组织，最后只能褐化死亡；而包含了此部分的外植体可成功诱导，且此伤口部位也是愈伤最初的着生部位。作为优选，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基为：MS4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸1～2mg/L，pH5.8。作为优选，步骤(1)中，培养的条件为：25±2℃条件下，全黑暗培养45～60d。作为优选，步骤(2)中，所述增殖培养基为：MS4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.5～1.0mg/L，pH5.9。因诱导蓝晶花属植物愈伤组织并维持愈伤组织的持续增殖较为不易，所以在诱导培养过程中，需要每30d继代一次，将诱导形成的愈伤组织团块连同其雄蕊外植体一起转接至新鲜的愈伤诱导培养基上至不定芽形成。因为此时刚刚诱导出的愈伤组织无法直接从培养基中吸收营养，所以需要连带外植体一同继代，通过外植体母体来传递养分；如果过早的将其从母体上剥离下来单独接种，会导致愈伤组织的干瘪或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取雄蕊，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；(2)将小鳞茎从步骤(1)所述愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；(3)取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。

【技术特征摘要】
1.一种以雄蕊为外植体建立蓝晶花小鳞茎再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取蓝晶花花蕾，消毒处理后，切取雄蕊，接种于愈伤诱导培养基上，培养获得含小鳞茎的愈伤组织；(2)将小鳞茎从步骤(1)所述愈伤组织中剥离下来，并转入增殖培养基中，培养获得小鳞茎增殖体；(3)取所述小鳞茎增殖体，接入生根培养基中，进行小鳞茎的膨大和生根诱导，获得蓝晶花小鳞茎。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝晶花花蕾为处于含苞期且长1.5～2.5cm的花苞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理的过程，包括：将所述蓝晶花花蕾置于4℃下冷藏1周后，用表面活性剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后，再用消毒试剂浸泡蓝晶花花蕾，清洗后，得到已消毒的蓝晶花花蕾。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基为：MS4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，6-苄氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏宜平，任梓铭，李岳，张栋，吴昀，孙敏译，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33