控制红刺玫花色二氢黄酮醇4-还原酶基因序列及其克隆方法，属于基因的克隆技术及其序列分析技术领域，是涉及红刺玫二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆方法及其编码蛋白质应用技术。其要点是该基因在红刺玫花内存在至少两个，均具有一个完整的基因编码区域；该基因的核苷酸序列是附录1所示；所编码的蛋白质序列是附录2所示；改变134位氨基酸的组成是改变红刺玫花色的必要条件。其克隆方法，包含以下步骤：设计两个引物，提取红刺玫花苞，引物参与，进行PCR反应，对红刺玫DFR基因进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测实施。本发明专利技术后的积极效果是：为改变红刺玫的单一花色弊端创造了条件，利用克隆技术创造出红刺玫新的花色，为城市绿化美容创造了条件。
【技术实现步骤摘要】
属于基因的克隆技术及其序列分析
，具体地说是涉及红刺玫二氢黄酮醇 4-还原酶基因的克隆方法及其编码蛋白质在改变花色时的应用技术。
技术介绍
HMM (Rosa multiflora Thunb. var. cathayensis Rehd. et ffils.) , 禾4* 属野蔷薇的一个变种。中国原产。伞房花序、花期长以及高耐湿热气候特性成为黄淮海流域和城市高架绿化的新宠。然而红刺玫花单瓣、花色单一限制其广泛应用，且天然的三倍体起源使得对其进行传统杂交育种很难得到改良的子代，改变其花色会提高其应用价值。目前有关控制红刺玫花色的基因克隆还未见报道，对其花色形成机制的研究也相对较少。为了更好的保护和利用该资源，利用基因工程改变红刺玫花色前景看好。在植物的花色合成的途径中，二氧黄酮醇4-还原酶(DFR)基因起着决定作用，克隆出红刺玫DFR基因尤为关键。花色素苷有三种类型，根据羟基的位置和数目，分为翠雀素色素苷、花青素色素苷及花葵素色素苷，这三种色素苷均以配糖体形式存在。花青素的生化合成包括一系列的化学反应，花青素的生化合成中有15个结构基因和2类调节基因参与，并有许多酶催化完成， 对这些基因和酶的调节直接影响植物色彩表达(见图1)。DFR就是在还原型辅酶II (NADPH) 的参与下，不同物种DFR选择不同的底物，合成不同的花色素，呈现不同的花色。二氢杨梅黄丽(dihydromyricetin, DHM)、二氧栋皮醇(dihydroquercetin, DHQ)禾口二S茨非醇 (dihydrokaempferol,DHK)在DFR酶的作用下分别合成无色的翠雀素，花青素和花葵素，最后在DFR、花色素苷合成酶(anthocyanin synthase, ANS)等酶的作用下合成各种相应的翠雀素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、花葵素-3-葡萄糖苷，分别表现出蓝紫色、粉色至红紫色、橙红色至红色。即在复杂的花色形成过程中，呈现不同颜色的花色素的积累主要是依赖于DFR基因的活性，失去DFR活性的突变体产生象牙色或者白色。所以，调节DFR酶的合成可以控制花色形成的途径，创造出新的花色。花色合成的途径中，DFR基因起决定性作用。蔷薇属植物的DFR基因主要催化该基因的第142-1M位点即VYNESNWSDVEFCR核酸序列生成花葵素，形成橙红色的花色。利用基因工程改变内源DFR基因即可以达到改变植物花色的目的。因此得到红刺玫的DFR基因对改变其花色具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于为了改变红刺玫的单一花色的弊端，创造出新的花色，以便在绿化美化城市中得到更广泛的应用。为此，本专利技术要提供控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因序列及其克隆方法。本专利技术采取的技术方案控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶基因序列，其方案在于该基因在红刺玫花内存在至少两个，均具有一个完整的基因编码区域；该基因的核苷酸序列是附录1所示； 所编码的蛋白质序列是附录2所示；其碱基序列和氨基酸序列显示红刺玫中DFR与NADP结合位点“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 和“TSSAG TVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 是高度保守的底物结合区，结合区中的第134位氨基酸直接影响酶的底物特异性；红刺玫DFR基因编码的氨基酸序列显示，其DFR高度保守的底物结合区是134位是名为天冬酰胺的N，其 DFR酶的底物为DHK或者为DHQ ；催化生成花葵素_3_葡萄糖苷或者为花青素_3_葡萄糖苷，显现出砖红色或者红色；改变134位氨基酸的组成是改变红刺玫花色的必要条件。控制红刺玫花色的二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆方法，具体的操作步骤如下1)设计两个引物如下RosaDFR-F :ATGGCATCGGAATCCGAGTC RosaDFR-R TTAGCCTGTGACTTTGACACG2).提取红刺玫花苞的mRNA，RT-PCR反转录为cDNA ；3).弓I 物0· 8μ L，dNTP(2mM) :1· 2μ L，10*PCR KOD buffer :2μ L，KOD-Plus 0. 5 μ L，cDNA :0. 5 μ L，灭菌双蒸水14. 2 μ L ；4).按照下述条件进行 PCR 反应94°C 3min,94°C 30s, 62°C 30s, 68°C lmin，30 个循环，68°C延伸 IOmin, 10°C保存 IOmin ；5).对红刺玫DFR基因进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条约为1. Okb 特异性条带。测序按常规将PCR合成后后纯化进行末端加A反应，然后再加反应后的基因与PMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌Dffia感受态菌株，涂布Amp+琼脂培养平板，37°C过夜，挑取8个克隆进行小量质粒提取，所得到的质粒经酶切及菌落PCR，并用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认获得阳性克隆，重组质粒命名为PMD-DFR。并送到博尚生物有限公司进行测序。取PMD-DFR质粒进行核苷酸序列测定，结果表明，红刺玫的二氢黄酮醇4_还原酶基因全长1050bp，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列分别见附录。红刺玫体内二氢黄酮醇 4-还原酶基因至少存在两个，分别命名为DFRA和DFRB。全长均为1050bp，两个DFR基因在15个碱基处存在差异。两个基因具有一个完整ORF阅读框，两者编码氨基酸的均为349 个，编码氨基酸存在8处差异。红刺玫编码的DFR基因的蛋白质在目前报道出的所有二氢黄酮醇4-还原酶基因中最短的一个。通过对碱基序列和氨基酸序列分析，红刺玫中DFR与 NADP结合位点“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF”是高度保守的底物结合区，结合区中的第134位氨基酸可直接影响酶的底物特异性，通过对红刺玫DFR基因编码的氨基酸的序列分析，结果显示他们的部分区域很保守，这些区域可能与他们的功能发挥有重要的作用。其 DFR高度保守的底物结合区的134位是N(天冬酰胺)，所以其DFR酶的底物为DHK或者为 DHQ。催化生成花葵素-3-葡萄糖苷或者为花青素-3-葡萄糖苷，显现出砖红色或者红色。 所以改变134位氨基酸的组成是改变红刺玫花色的必要条件。实施本专利技术后的积极效果是实施本专利技术后为改变红刺玫的单一花色弊端创造了条件，利用克隆技术能创造出红刺玫新的花色，为城市更好绿化美容创造了条件。附图说明图1.花色素生化合成途径，图2. DFR全长基因，图3. PMD-DFR重组质粒图附录1红刺玫二氢黄酮醇4-还原酶基因>DFRA1ATGGCATCGGAATCCGAGTCCGTTTGCGTGACAGGCGCCTCCGGTTTCGT51AGGTTCATGGCTCGTCATGAGACTCCTAGAGCGCGGCTACACTGTCCGAG101CCACCGTGCGAGACCCTGCTAATTCGAAGAAGGTGAAGCATCTGCTGGAC151TTACCAAAGGCGGCGACTCACTTGACGCTGTGGAAGGCAGACCTGGCGGA201GGAGGGAAGCTTCGACGAAGCCATCAAGGGATGCACCGGAGTGTTCCAT本文档来自技高网...
【技术保护点】
列显示，其ＤＦＲ高度保守的底物结合区是１３４位是名为天冬酰胺的Ｎ，其ＤＦＲ酶的底物为ＤＨＫ或者为ＤＨＱ；催化生成花葵素－３－葡萄糖苷或者为花青素－３－葡萄糖苷，显现出砖红色或者红色；改变１３４位氨基酸的组成是改变红刺玫花色的必要条件。合位点“ＴＡＳＡＧ ＳＶＮＶＥＥＴＱＫＰ ＶＹＮＥＳＮＷＳＤＶ ＥＦ”和“ＴＳＳＡＧ ＴＶＮＶＥＥＴＱＫＰ ＶＹＮＥＳＮＷＳＤＶ ＥＦ”是高度保守的底物结合区，结合区中的第１３４位氨基酸直接影响酶的底物特异性；红刺玫ＤＦＲ基因编码的氨基酸序１．控制红刺玫花色的二氢黄酮醇４－还原酶基因序列，其特征在于：该基因在红刺玫花内存在至少两个，均具有一个完整的基因编码区域；该基因的核苷酸序列是附录１所示；所编码的蛋白质序列是附录２所示；其碱基序列和氨基酸序列显示红刺玫中ＤＦＲ与ＮＡＤＰ结
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张冬梅，姜灵敏，罗玉兰，马伟，
申请(专利权)人：上海市园林科学研究所，
类型：发明
国别省市：31
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