本发明专利技术提供了一种用于检测空肠弯曲菌的特异抗原，为空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶AhpC(Alkyl?Hydroperoxide?Reductase，AhpC)重组蛋白抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，编码该抗原基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术提供的特异抗原可用于定量、定性检测血清中空肠弯曲菌特异抗体的各种检测试剂及试剂盒的制备。本发明专利技术还提供了以该抗原作包被原的ELISA检测试剂盒，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，可用于临床检测血清中空肠弯曲菌的抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测空肠弯曲菌抗体的特异诊断蛋白抗原，具体地，是空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶(Alkyl Hydroperoxide Reductase, AhpC)蛋白抗原及其应用。
技术介绍
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症(Guillain-Barre Syndrome，GBQ，给人类带来严重的疾病负担。空肠弯曲菌感染后导致GBS的机理是由于病原与外周神经细胞上的神经节苷脂有共同的抗原成分，感染后产生特异抗体的错误识别造成神经的损伤。空肠弯曲菌感染后血清特异抗体的检测是确定空肠弯曲菌的前期感染以及进行GBS的病因分析的主要手段。目前由于这种特异检测抗原的缺乏，造成空肠弯曲菌感染后抗体检测试剂以及检测方法的缺乏。研究发现空肠弯曲菌不同菌型菌株感染产生的抗体的种类及其类神经节苷脂靶点的种类不同，从而导致神经病变的损伤不同。我国导致GBS的空肠弯曲菌菌株的菌型主要为HS :41和HS 19，腹泻患者感染菌株的血清型主要为HS :37，HS :6，7等。迄今，国际上只有一种的检测空肠弯曲菌抗体商业ELISA试剂盒，其为德国生产，但该试剂盒对于我国菌株感染的检测灵敏度较低。目前还没有针对我国菌株感染特异抗体检测的相关特异性诊断抗原。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种空肠弯曲菌AhpC蛋白抗原；本专利技术的第二个目的在于提供编码上述AhpC蛋白的基因；本专利技术的第三个目的在于提供上述AhpC蛋白的用途，以弥补目前针对我国空肠弯曲菌感染特异抗体检测没有相关特异性抗原的空白。为实现上述目的，本专利技术首先对空肠弯曲菌菌株NCTC11168的ahpC基因DNA序列进行自主测序，用BLASTn与Vector NTI Suite 6. 0软件对NCBI公布的测序菌种ahpC基因的DNA序列进行比对，结果发现，不同菌株的ahpC基因皆为597bp，菌株间DNA序列没有明显的缺失及插入，不同菌株共有12个碱基存在差异，一致性为98%，证明ahpC基因在空肠弯曲菌菌种内具有高度的保守性。其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的AhpC的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第30位的天冬酰胺N替换为甘氨酸G，或是将第35位的甘氨酸G缺失，或是在第M位增加丙氨酸A，均不影响其生物活性。因此，本专利技术AhpC还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与AhpC同等活性的由AhpC衍生得到的蛋白质。本专利技术基因包括编码上述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本专利技术ahpC基因还包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码AhpC的核苷酸序列。ahpC基因的DNA序列经NCBI的Blast数据库的比对，发现仅与幽门螺杆菌有部分交叉。本专利技术将6株幽门螺杆菌的基因ahpC的碱基序列，其中有4株菌有542个碱基，2株菌有597个碱基，进行6株已知序列的幽门螺杆菌ahpC基因与空肠弯曲菌ahpC基因序列进行比对，一致性仅为62%，而与大肠杆菌0157，弗氏埃希氏杆菌，肠炎菌株，弗氏志贺菌， 鲍氏志贺(氏)菌等其它肠道细菌相比，DNA —致性为45. 1%。说明ahpC基因的DNA序列与其它病原相比具有特异性。本专利技术提供了一种重组表达载体，含有以空肠弯曲菌AhpC蛋白编码基因为目的基因的表达盒。本专利技术的重组表达载体为PGEX-ahpC。本专利技术的空肠弯曲菌AhpC蛋白具有弯曲菌相关毒力因子的特征，且具有良好的抗原性，特异性，可用于检测空肠弯曲菌特异抗体。针对AhpC蛋白的上述特点，本专利技术还提供了一种空肠弯曲菌抗体的检测方法。本专利技术所述的空肠弯曲菌抗体的检测方法，是以AhpC重组蛋白为抗原，以间接 ELISA方法检待测样本中的空肠弯曲菌特异抗体。为了使上述方法操作更简便，本专利技术还提供了一种空肠弯曲菌抗体检测酶联免疫吸附试剂盒。本专利技术的空肠弯曲菌抗体酶联免疫吸附试剂盒，以上述的AhpC重组蛋白为包被抗原。该试剂盒还含有酶结合物工作液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、 显色液和终止液。酶结合物工作液可以用辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌A 蛋白，简称SPA，阳性对照可以用兔免疫C. jejuni标准阳性血清，阴性对照可以用兔标准阴性血清。本专利技术的AhpC蛋白为非全菌抗原，与空肠弯曲菌免疫血清、空肠弯曲菌标准阳性血清反应，不与幽门螺杆菌、大肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、霍乱弧菌等肠道细菌的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，特异性强。以AhpC蛋白为抗原，以ELISA方法可以检测空肠弯曲菌抗体，该方法操作简便，检测快速，成本低，可用于我国空肠弯曲菌感染特异抗体的检测。附图说明图1.为PCR扩增ahpC基因结果的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1 :DNA marker, 泳道2,3,4 :ahpC的PCR扩增产物，大小597bp。图2.为重组质粒PGEX-ahpC的双酶切鉴定结果图，其中IDNA marker ；2重组质粒 PGEX-ahpC双酶切结果；3重组质粒PGEX-ahpC。图3.为SDS-PAGE电泳图，其中1.蛋白marker ；2.宿主菌BL21的诱导；3.转化体PGEX-BL21诱导后；4.转化体BL21_AhpC未诱导；5.转化体BL21_AhpC沉淀；6.转化体 BL21-AhpC上清；7. AhpC纯化蛋白。图4.为AhpC蛋白免疫印迹分析图，其中泳道1.蛋白maker ;2.菌株ICDCCJ07001 全菌蛋白；3. GBS散发株免疫前的兔血清；4. GBS散发菌株免疫兔血清；5. GBS爆发株 ICDCCJ07001免疫前兔血清；6. GBS爆发株ICDCCJ07001免疫后兔血清；7. NCTCl 1168免疫前兔血清；8. NCTCl 1168免疫后兔血清；9.结核杆菌免疫兔血清；10.蛋白maker ；11.空表达载体PGEX-4T-1散发株免疫后的兔血清。图5.为AhpC抗原对空肠弯曲菌免疫前和免疫后血清抗体检测结果图，其中纵坐标为检测结果的OD值，横坐标为1-11份稀释了的血清，其稀释度分别从1 100至 1 102400。图6.为AhpC抗原对空肠弯曲菌和其他病原免疫血清抗体的ELISA检测结果图， 纵坐标为ELISA检测空肠弯曲菌及其它病原免疫血清的OD值，横坐标为1-11份稀释了的血清(从1 11，稀释度分别为1 100至1 10M00)，几种免疫血清分别为空肠弯曲菌免疫前血清，空肠弯曲菌免疫后血清，幽门螺杆菌免疫血清，小肠耶尔森氏菌08免疫血清， 小肠耶尔森氏菌09免疫血清，大肠0 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶ＡｈｐＣ蛋白，其氨基酸序列为：ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示的氨基酸序列；或ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张茂俊，张建中，孟凡亮，曹芳芳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11
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