本发明专利技术涉及用于目标物质筛选的荧光法中荧光测试样品的制备方法，包括1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)所述生物活性物质的底物，底物两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；2)将1)中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；3)向2)中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。本发明专利技术还涉及按照上述方法制备的荧光测试样品(验证组)，以及用于对照的(筛选组)和(阴性对照组)。本发明专利技术还涉及用于目标物质筛选的荧光法中由于荧光淬灭作用引起的假阳性样品的排除方法，以及所述排除方法用于排除荧光法筛选中假阳性结果，特别是荧光淬灭作用引起的假阳性结果的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物筛选领域，具体来讲，本专利技术涉及一种在体外分子水平采用荧光法来排除基于荧光技术的药物筛选假阳性结果的方法。
技术介绍
药物高通量筛选(high-throughput screening, HTS)是发现创新药物的重要技术手段，对大规模化合物库的高通量筛选是药物研发领域寻找先导化合物的主要来源，与传统方法相比，HTS在微量条件下进行，采用自动化操作系统，可以实现大规模的筛选，通过活性数据处理过程确定化合物的药物活性，为基于信息的药物发现过程准备准确、丰富的资料，因而筛选过程本身已不再是新药发现的瓶颈。但是筛选通量的巨大增长并没有带来相应的大量新化学实体被鉴定为待开发候选分子，究其原因，除可通过吸收、分布、代谢、排泄、毒性(ADMET)研究解决的药代动力学及毒理学等相关问题外，筛选过程中化合物的性质及成药性也是一个重要因素。另一方面，筛选过程本身也存在问题，尤其是采用广泛用于药物高通量筛选中的专业化检测技术，为保证通量，这些技术虽然避免了过多的操作步骤，能够进行连续操作， 从而降低了消耗时间的步骤，但其缺点在于后续反应产物检测时待测样品仍存在于反应体系中，从而导致待测物非目标检测性质的干扰问题。这些可通过采用其他独立检测技术对所得结果进行反筛选(coimterscreening)以验证结果，或者将待测物加入已经停止的反应体系以区别假象(artifact)。尽管如此，一些假阳性结果仍然无法排除。由于这些假阳性结果的存在，导致后续药物研发的巨大投入，造成人力、物力和财力的巨大浪费。荧光检测方法具有灵敏度高、方法简便的优点，因此，近年来，基于荧光技术的检测分析方法被广泛应用于药物的高通量筛选(HTS)。目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光法(homogeneoustime resolved fluorescence, HTRF)、荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)、焚光关联光谱法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)、极化焚光分析法(fluorescence polarization,FP)等。 在这些方法中，HTRF法由于发射光较窄的带宽与较长的衰减周期、激发光波长与发射光波长间巨大的斯托克斯位移(Stoke’ s shift)从而可以检测特异性信号，排除短寿命荧光信号造成的假阴性结果，因此，得到越来越多的应用。HTRF的原理是生物活性物质(主要是酶)的底物两端分别偶联荧光淬灭基团和荧光发射基团，当反应体系中存在相应生物活性物质(主要是酶)的活性时，底物被切割后荧光淬灭基团和荧光发射基团分离，采用具有一定波长激发光的检测器进行激发即可检测到特定波长发射光。将HTRF应用于药物筛选中时，其操作过程是将待筛选样品与生物活性物质在一定条件下孵育一定时间后加入生物活性物质的底物，在适宜条件下孵育一定时间，以一定波长激发光激发后检测特定波长发射光强度，若待测样品抑制生物活性物质的活性时，其底物切割程度降低，因而所检测到的发射光强度降低，由此可筛选出具有抑制活性的待测样品。HTFR虽然具有可以检测特异性信号，排除短寿命荧光信号造成假阴性结果等诸多优点，但是却无法排除化合物对荧光的淬灭作用所造成的假阳性结果。目前，在药物高通量筛选中用于排除HTRF法筛选结果假阳性验证的方法主要依赖于质谱法、高效液相色谱法等，这些手段存在通量低、成本高等瓶颈问题，而且对设备依赖程度高，不能满足药物研发领域对于低成本与高效率的要求。针对这个问题，本专利技术开发了一种既简单，又省时、省力，低成本、高效率的排除HTRF等荧光筛选方法中假阳性结果的方法。综上所述，针对基于荧光法进行药物筛选时对于具有荧光淬灭作用的样品造成的假阳性结果无法排除，而质谱法等排除假阳性的方法无法实现高通量且成本较高，造成目前缺少高通量、高灵敏度且简单易行的方法的现状，促使了本专利技术的研究。
技术实现思路
为了解决上述问题，排除体外分子水平药物高通量筛选中的假阳性结果，特别是荧光淬灭作用造成的假阳性结果，本专利技术公开了一种采用荧光法进行体外分子水平药物筛选假阳性结果的排除方法。该方法从HTRF法药物筛选技术改进而来，通过改变生物活性物质、底物和待测目标物质的加样顺序来实现，其基本原理为生物活性物质与底物室温反应一定时间产生足以检测到的荧光，加入待测目标物质，检测荧光强度随反应时间的变化趋势，根据荧光强度的变化得出结果。采用该法可区分待测目标物质自身对荧光的淬灭作用与待测目标物质抑制酶的活性从而降低酶水解底物最终致使荧光减弱的作用，适用于基于荧光的方法(如时间分辨荧光、荧光能量共振转移等)进行药物筛选时假阳性结果的排除。本专利技术的一个方面涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中荧光测试样品的制备方法，包括1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)所述生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；2)将1)中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；3)向2)中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。本专利技术的另一方面涉及一种按照上述方法制备的荧光测试样品验证组。本专利技术还涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品筛选组，其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品筛选组。本专利技术还涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品阴性对照组， 其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质的溶剂，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品阴性对照组。以上所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；在本专利技术的一个实施方案中，所述荧光法为均相时间分辨荧光法。所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；在本专利技术的一个实施方案中，所述切割酶为BACE1。所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；在本专利技术的一个实施方案中，所述底物为APP(淀粉样前体蛋白)或突变型APP。所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；在本专利技术的一个实施方案中，所述荧光淬灭基团为QSY7。所述荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS(5’ -(2’ -氨乙基氨基奈磺酸))、Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；在本专利技术的一个实施方案中，所述荧光发射基团为铕螯合分子。所述一定条件是指反应温度为0 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为 0 24hr ；在本专利技术的一个实施方案中，所述一定条件是指反应温度为20 25 V，反应pH 值为4. 5，所述孵育时间在验证组为6hr，在筛选组和阴性本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种荧光测试样品的制备方法，所述荧光测试样品用于荧光法中目标物质的筛选，所述制备方法包括：１）向反应板中加入ａ）生物活性物质，和ｂ）所述生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；２）将１）中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；和３）向２）中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张永祥，程肖蕊，周金武，周文霞，程军平，杨日芳，聂爱华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。