一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，名称为TK2，分类名称Clostridium?butyricum，保藏编号为：CGMCC?No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，提供了一种生产方法为固态发酵培养法。本发明专利技术中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化，再经优化后的固态发酵培养基培养，并对其活菌浓度及芽孢浓度测定，用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4.35×109cfu/g，芽孢转化率85％，基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制剂生产方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵领域，涉及。
技术介绍
丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是对宿主有益的正常微生物，经特殊工艺而制成的制剂，通过动物消化道中生物的竞争性排斥作用，可抑制有害菌生长， 形成优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，可达到调整体内微生态平衡的目的，促进动物生长及提高饲料转化率，降低粪便的臭味。在使用抗生素的弊端日益凸显的背景下，丁酸梭菌活菌制剂所具备的诸多优势使其在预防治疗肠道疾病中具有重要意义。目前所报道的丁酸梭菌的培养方法主要是液体深层静置培养，其固态发酵培养方法国内外未见报道，但是液态培养的成本较高，对设备和环境的要求也相对较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种成本低、培养基来源广泛、 操作简单的丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法。本专利技术实现目的的技术方案如下一种丁酸梭菌，其特征在于名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为CGMCC No. 4729，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。—种丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，生产方法为固态发酵培养法。而且，所述固态发酵培养基为重量百分比酶解氮源20-30、米糠5-15、葡萄糖 1-2、啤酒酵母粉2-3、CaCO3 0. 01-0. 1、加水至100%，所述酶解氮源的制备方法为豆粕加水重量比为1 2，中性蛋白酶用量IOOOu每克豆粕，酶解池，所述酶解氮源为酶解豆粕、 酶解花生粕、酶解黄豆粕、酶解棉籽粕。而且，所述固态发酵培养基的重量百分比为酶解豆粕27 ；米糠9 ；葡萄糖1. 5 ；啤酒酵母粉 2. 5 ；CaCO3 0. 02 ；水 60。而且，所述固态发酵培养条件为接种量10%，37士 1°C静置厌氧培养40-5 ！。而且，固态发酵培养前进行液体种子培养，其中液体种子培养基为g/L 葡萄糖 5-10 ；胰蛋白胨 5-15 ；酵母膏 26、K2HPO4 3-7、MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5、MnSO4 · H2O 0. 1-0. 5g、 溶剂为水，培养条件为pH7. 4，培养18小时，培养温度为37°C，厌氧培养。而且，固态发酵培养的活菌菌体浓度及芽孢率均分别为4. 35X 109cfu/g和85%。本专利技术的优点和积极效果是1、本专利技术中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化，再经优化后的固态发酵培养基培养，并对其活菌浓度及芽孢浓度测定，用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4. 35X 109cfu/g，芽孢转化率85%，基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制3剂生产方法。2、本专利技术首次采用固态发酵法发酵厌氧型丁酸梭菌，与原液态发酵相比，固态发酵能耗小、培养基来源广泛、设备相对简单、产物浓度高，具有投资少、操作简单、物质损耗小、能耗低、发酵管理简单的优势。3、本专利技术确定了在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下，接种量为 10%时活菌数及芽孢率最为理想，分别可达4. 35 X 109cfu/g, 85 %，无机盐成分对菌体的生长影响不明显；碳酸钙用以中和其产生的酸性成分，有利于菌体生长。4、本专利技术首次提供了丁酸梭菌TK2利用廉价的豆粕、花生粕、黄豆粕、棉籽粕作为氮源，用中性蛋白酶处理后，其利用率得到了很大的提高，尤其是经水解池后的豆粕，效果显著，活菌数高达4. 35X 109cfu/g，为丁酸梭菌规模化生产极大的降低了成本，中性蛋白酶水解池的豆粕作为氮源为最优选择。附图说明图1为本专利技术各氮源水解时间对丁酸梭菌活菌数的影响；图2为本专利技术含水量对丁酸梭菌活菌数的影响；图3为本专利技术接种量对丁酸梭菌活菌数及芽孢浓度的影响；图4为本专利技术培养时间对丁酸梭菌芽孢浓度的影响。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。一种丁酸梭菌TK2，分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为CGMCC No. 47 ，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，以下叙述均基于该菌株。1. 丁酸梭菌TK2的筛选(1)以土壤作为样品；( 涂布梭菌分离培养基平板，初步得到纯菌株；C3)影印好氧与厌氧培养，除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌；(4)镜检，依据《伯杰氏细菌手册》，从菌落形态及个体形态以及严格厌氧型能鉴定到属，对所得到的菌株进行明胶液化试验及芽孢位置染色试验，可以鉴定到群，在群内进行蜜二糖、松三糖、淀粉利用试验，鉴定到种。(5)将分离出的丁酸梭菌于甘油管中-70°C冻藏。2.菌体的种子制备将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的试管中，37°C静置厌氧培养18h。其中液体种子培养基(g/L)为葡萄糖8g ；胰蛋白胨IOg ；酵母膏4g ;K2HP04 5g ； MgSO4 · 7H20 0. 2g ；MnSO4 · H2O 0. 2g ；pH 7. 4，培养 18 小时，培养温度为 37°C厌氧培养。3.培养基制备豆粕加水比为1 2，中性蛋白酶用量lOOOu/g(豆粕)，酶解池后加入固态发酵培养基与其他成分一并于115°C灭菌30分钟。所用中性蛋白酶ZDB-G-20购自天津诺奥科技发展有限公司。固态发酵培养基为(重量百分比)中性蛋白酶水解池的豆粕27%;米糠9%;葡萄糖1. 5% ；啤酒酵母粉2. 5% ；CaCO3 0. 02% ；水60%，pH自然。4.固态发酵将培养至对数期中期的液体种子以10%的接种量接到固态发酵培养基中，然后在厌氧培养箱中37士 1°C静置培养48h。5.菌体浓度的测定采用高层半固体琼脂试管活菌计数法，其流程为称取固态发酵鲜曲10g，放入盛有90mL无菌生理盐水(含数粒玻璃珠)的150mL三角瓶中，置摇床180r/min振荡20min， 使其分散均勻，用移液管取ImL菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅勻，依次做 10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，选择合适稀释度做三个平行，厌氧培养箱37°C 培养Mh。6.芽孢浓度的测定取混勻后的菌液5ml于80°C水浴加热lOmin，杀死营养体细胞，经适当的10倍梯度稀释，其后同活菌计数法。以下是对发酵培养基的确定，包括无机盐、氮源、发酵培养基含水量等参数的确定，以及发酵培养条件的优化选择一、固态发酵条件的筛选1、丁酸梭菌TK2发酵培养基无机盐的确定筛选实例1固态发酵培养基(％)未水解豆粕27 ；米糠9 ；葡萄糖1. 5 ；啤酒酵母粉2. 5 ；CaCO3 0. 02 ；MgSO4 0. 02 ；MnSO4 0. 02 ；K2HpO4 0. 06 ；水 60。接种与培养条件接种量10% (v/w)，pH自然，培养温度37士 1°C，培养时间48h。测得的活菌数为4. 5X 108cfu/g。筛选实例2固态发酵培养基(％)未水解豆粕27 ；米糠9 ；葡萄糖1. 5 ；啤酒酵母粉2. 5 ；CaCO3 0. 02 ；水 60。接种与培养条件接种量10% (v/w), pH自然，培养温度37士 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种丁酸梭菌，其特征在于：名称为ＴＫ２，分类名称Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ，保藏编号为：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．４７２９，保藏日期：２０１１年４月２日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路１号院３号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王海宽，刘菲菲，戚薇，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12