一种TAFI含量的体外检测方法，利用PAMAM树状多聚物能与抗体结合的生物特性，与传统ELISA方法相结合，将其用于TAFI含量的体外检测，开辟了TAFI新的体外诊断学方法，提高了TAFI体外检测的灵敏度。该方法包括包被抗体的酶标板，样品稀释液，TAFI标准品，洗净液，PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，抗体稀释液，显色缓冲液，30％过氧化氢，邻苯二胺和终止液的TAFI含量体外检测试剂盒。它解决了现有技术存在的设备昂贵，检测时间较长等缺陷，与其它检测试剂盒相比，具有操作简便、快捷，成本低廉，诊断敏感，检出限低等优点，作为辅助诊断，提高相关疾病的检出率和准确率，达到了早期发现，早期治疗的目的；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用支出，提高被检者的生存质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于临床预测心脑血管疾病等发生可能性的检测凝血酶激活的 纤溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor，简称TAFI)含量的新方法， 特别是用于检测人个体生物样品，如血液、血清、血浆、尿液、粘液、粪便、脑脊液、胸腔积液、 腹水、唾液、组织或细胞等的TAFI含量的体外检测方法。在医学检验中，它主要通过对人个 体生物样品中的TAFI含量的体外测定，以辅助心脑血管疾病、急性早幼粒细胞白血病、内 源性凝血系统缺陷疾病、炎症等相关疾病的诊断和大规模临床普查。
技术介绍
众所周知，血栓性疾病是一类严重影响健康的疾病，尤其是心脑血管栓塞性疾病 已成为我国人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的临床表现千差万别，诊断和治疗往往 非常复杂，因此，早期发现、早期治疗尤为重要。目前，血栓性疾病的检查方法主要有心电 图、超声心动图、胸部X射线、血压监测、头颅X射线、脑CT扫描、脑MRI检查、DSA、MRA、经颅 多普勒超声检查等。射线类检查会对人体产生一定程度的电离辐射，组织血流灌注的功能 性成像检查方法较多，这些检查设备通常比较昂贵，增加了成本，有的还需特殊装备，成像 时间较长，无法短期获得结果。在医学检验中，尚缺乏一种简单、快捷、准确的用于临床预测 心脑血管疾病等发生可能性的检测方法，不利于对疾病的早期发现，早期治疗。据相关文献报导，TAFI具有被凝血酶激活后下调纤溶活性的功能，是一种存在于 血浆中的含金属ai的羧肽酶前体，又被称为血浆羧肽酶原B、血浆羧肽酶原U、血浆羧肽酶 原R。TAFI前体由肝脏合成，是一条包含423个氨基酸的单链糖蛋白，在循环至血液中的过 程中，切掉N端22个氨基酸的信号肽，形成401个氨基酸的56kDa的TAFI ；TAFI也存在于 血小板内，血小板激活时释放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶等蛋白水解酶可以作用于 TAFI的Arg92，将其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具 有切除部分降解的纤维蛋白C端Arg或Lys的能力，使纤溶蛋白酶原不能被激活，因而具有 下调纤溶系统的功能，但其构象具有高度不稳定性。TAFI于1988年被首次发现，活化后具有内在不稳定性，通常在37°C条件下孵育池 失去活性，并且能特异性地分解底物上精氨酸。后经多位科技工作者对其cDNA进行分离以 及测定，并利用纤溶酶原-琼脂糖柱层析的方法从血浆中分离、提纯其酶原蛋白pro-pCPB， 进一步分析发现TAFI通过凝血酶激活后具有羧肽酶活性，发挥纤溶抑制作用。TAFI与心脑血管疾病有一定关系。动脉粥样硬化(atherosclerosis，简称AS)是 缺血性心脑血管疾病(如心绞痛、心肌梗死、脑卒中等)共同的病理基础，也是导致血管内 血栓形成的主要原因。近几年的研究表明，AS的发生发展与炎症、凝血-纤溶调节系统密 切相关。目前研究表明，TAFI通过降低纤溶活性可促进静脉血栓的形成，血浆高TAFI水平 能增加静脉血栓事件。目前，用来检测TAFI水平的方法主要有两类，一类是通过测定酶活力的方法间接 测定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶调节蛋白激活TAFIjIUS TAFIa的酶活力 ’另一类是免疫学方法，包括酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 和火箭免疫电泳。其中，夹心ELISA法检测TAFI抗原是目前相对成熟的检测方法，检测灵 敏度高，特异性强，准确性好，检测方法安全易行。2005年出现了两种针对TAFI的特异性单 克隆抗体，成功运用ELISA方法检测TAFI、TAFIa和失活的TAFI。但这些方法因自身存在 一定的缺陷，都没有成为国际公认的TAFI参照标准法。本专利技术人曾在专利号为CN200410020546. X的“乳腺癌的Her_2免疫组织化学诊 断试剂盒”中，利用含氨功能基高分子PAMAM树突状物的生物特性标记抗体，进行乳腺癌的 Her-2免疫组织化学的体外诊断，可使检测乳腺癌获得准确的判断结果。由此，开辟了新 的体外诊断学方法。PAMAM(聚酰胺-胺)是一种纳米级树突状多聚物，PAMAM树状大分子 (PAMAM Dendrimer)是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合 物相比，可在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团，因而具有精确的分子结 构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性。经研究表明，用PAMAM来携带寡核酐酸基因 片段进行体内和体外实验，证明其具有非常好的传递功能；可应用PAMAM结合抗体片段靶 向性治疗前列腺癌。专利号为US2003/0044407A1的“标记抗体或抗体片段的免疫脂质或多 聚物用于系统治疗的传输或诊断试剂”中，也公开了一种应用PAMAM标记稀有金属和抗体 注入体内，通过核磁共振测定进行影像学诊断的方法。但是因其在体内分解、代谢所产生的 毒性作用尚不清楚，有动物实验研究表明，一定的PAMAM剂量可使小鼠产生溶血性变化。因 此，体内实验难于广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TAFI含量的体外检测方法，它解决了现有技术存在的 设备昂贵，检测时间较长等缺陷，与其它检测方法相比，具有操作简便、快捷、成本低廉，诊 断敏感，检出限低等优点，作为用于临床预测心脑血管疾病的辅助诊断，可显著提高疾病的 检出率和准确率，有利于疾病的早期发现，早期治疗；减少被检者不必要的痛苦和医疗费用 支出，提高被检者的生存质量。本专利技术所采用的技术方案的具体操作步骤如下步骤一采集人个体生物样品立即于30分钟内，4°C条件下离心取上清作为待检样 品，置于冰盒1小时内使用或-20°C保存备用；步骤二利用体外检测试剂盒，对待检样品进行TAFI含量测定；所述体外检测试剂盒的内容物包括捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗 原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检 样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净 液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶 联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的30%过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使 底物显色反应停止的终止液；检测操作时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用所 述抗体稀释液300倍稀释，所述TAFI标准品加入Iml所述样品稀释液溶解，所述酶作用 底物中各组分的用量比为邻苯二胺13mg 显色缓冲液体积13ml 30%过氧化氢体积 6. 5μ 1 ；步骤三利用所述样品稀释液对所述待检样品进行100-2000倍稀释；5步骤四取Iml样品稀释液溶解所述TAFI标准品，其浓度为48ng/ml，用所述样品稀 释液对48ng/ml的标准溶液做2倍梯度稀释，制成浓度分别为Mng/ml，12ng/ml, 6ng/ml, 3ng/ml, 1. 5ng/ml,0. 75ng/ml的标准工作液，以所述样品稀释液作为空白对照液；步骤五分别取所述标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品50μ 1，加入所述包 被抗体的酶标板孔中，每个样品2个重复，室温静置1小时，所述待检本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ＴＡＦＩ含量的体外检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：步骤一采集人个体生物样品立即于３０分钟内，４℃条件下离心取上清作为待检样品，置于冰盒１小时内使用或－２０℃保存备用；步骤二利用体外检测试剂盒，对待检样品进行ＴＡＦＩ含量测定；所述体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品ＴＡＦＩ抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检样品中的ＴＡＦＩ抗原含量的标准曲线的ＴＡＦＩ标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的３０％过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使底物显色反应停止的终止液；检测操作时，所述ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体用所述抗体稀释液３００倍稀释，所述ＴＡＦＩ标准品加入１ｍｌ所述样品稀释液溶解，所述酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺１３ｍｇ∶显色缓冲液体积１３ｍｌ∶３０％过氧化氢体积６．５μｌ；步骤三利用所述样品稀释液对所述待检样品进行１００－２０００倍稀释；步骤四取１ｍｌ样品稀释液溶解所述ＴＡＦＩ标准品，其浓度为４８ｎｇ／ｍｌ，用所述样品稀释液对４８ｎｇ／ｍｌ的标准溶液做２倍梯度稀释，制成浓度分别为２４ｎｇ／ｍｌ，１２ｎｇ／ｍｌ，６ｎｇ／ｍｌ，３ｎｇ／ｍｌ，１．５ｎｇ／ｍｌ，０．７５ｎｇ／ｍｌ的标准工作液，以所述样品稀释液作为空白对照液；步骤五分别取所述标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品５０μｌ，加入所述包被抗体的酶标板孔中，每个样品２个重复，室温静置１小时，所述待检样品中的ＴＡＦＩ抗原与包被在酶标板上的抗体特异结合，形成固相抗原抗体复合物；步骤六弃去酶标板孔中的液体，拍干，加入所述试剂盒的洗净液３００μｌ，静置１０分钟，弃去拍干，重复３次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中的未结合物质；步骤七取所述ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体２０μｌ，加入所述抗体稀释液６ｍｌ中，制成酶联抗体工作液；步骤八向结合有抗原抗体复合物的所述包被抗体的酶标板孔中加入所述ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体５０μｌ，室温静置１小时，所述ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体与所述固相抗原抗体复合物上的ＴＡＦＩ抗原结合；步骤九弃去所述包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入所述洗净液３００μｌ，静置１０分钟，弃去拍干，重复３次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中未结合的所述ＰＡＭＡＭ标记的辣根过氧化物酶联抗体，此时固相载体上带有的酶量与所述待检样品中受检抗原的量成正比；步骤十取所述邻苯二胺１片，溶解于所述显色液１３ｍｌ中，加入３０％所述过氧化氢６．５μｌ混匀，制成所述酶作用底物；步骤十一加入所述酶作用底物１００μｌ，避光反应１０分钟，固相上的酶催化所述酶作用底物成为淡黄色产物；步骤十二加入所述终止液１００μｌ终止反应，淡黄色产物立即转化为棕色，于４９２ｎｍ处测定吸光值；步骤十三根据所述ＴＡＦＩ标准品的吸光值与浓度的关系，制作标准曲线，根据标准曲线计算所述待检样品中ＴＡＦＩ抗原的含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文欣，
申请(专利权)人：辽宁迈迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：89
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