本发明专利技术属于基因工程领域，公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体及其工程菌的构建、串联体的表达、目的肽的制备方法。通过同尾酶法构建出一系列该类似物基因串联体，并将其融合伙伴进行改造同时引入His标签，融合蛋白中目的肽的比率由22％提高到90％，目的肽的表达量提高了2.7倍，通过Ni琼脂糖凝胶亲和层析和Sephadex?G-25葡聚糖凝胶层析获得的目的肽具有明显的促小肠绒毛生长活性。该制备方法具有目的肽表达量高、纯化过程简便、获取单体肽过程不需使用CNBr或水解酶等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物基因串联体及其工程菌的构建、串联体的融合表达、单体肽的制备方法及促小肠绒毛生长活性检测。
技术介绍
人胰高血糖素样肽-2(Glucag0n-like P印tide-2，GLP-2)属于肠道产生的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derived Peptide, P⑶P)家族成员之一，是一条由33个氨基酸残基组成的单链多肽，多肽的羧基末端为天冬氨酸。GLP-2是肠上皮特异性生长因子，具有肠道特异性及更强的促生长作用，促进肠黏膜生长、抑制肠上皮细胞和隐窝细胞凋亡等生物活性，研究发现其可以治疗或改善胃肠外营养依赖性短肠炎、炎性肠病、骨质疏松、肠粘膜损伤等炎症。由于天然的GLP-2易被二酰肽肽酶IV (Depiptidyl Peptidase IV，DPP- IV )降解而失去活性，所以近年来GLP-2的类似物的研究层出不穷，如NPS公司研发的一种耐DPP IV降解的GLP-2类似物Teduglutide 能促进短肠综合症患者营养的吸收，且安全性、耐受性良好。人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物已经实验证实具有明显体内促小肠绒毛生长的作用，并且其体内促肠生长活性与药物剂量呈正相关性。然而，大量制备较为困难，由于肽链较长使化学合成法步骤较多、成本高、率较低；基因工程法生产同样存在很多困难， 如长度在20 80氨基酸之间的肽类mRNA和表达的蛋白质在宿主细胞内不稳定，导致表达效率很低；用融合方式虽能获得高效表达，但从融合蛋白上释放出目标多肽相当困难，同时目的肽在融合蛋白中比率较小，最终造成产率低，制备不经济等问题，虽已有将部分线性肽目的基因串联起来，使目的基因在宿主菌中以串联体方式表达，虽可提高目标蛋白的表达效率，但表达的串联体产物通常经酶或化学试剂裂解获得目的肽单体，其中所用的酶一般成本较高；化学试剂如溴化氢存在毒性强等问题，使相关肽的生产和研究受到限制。融合蛋白的表达形式直接影响到下游工艺路线和最终产品的产率，已有的下游工艺路线为重组质粒pED-Pro-Pro-h Wly2]GLP-2 (1-35)表达的融合蛋白溶解后，经多次乙醇沉淀、等电点沉淀等获得融合蛋白粗品；酸水解后，通过离子交换获得目的肽粗品；HPLC 柱进一步去除因粗品融合蛋白带来的杂质。目的肽占融合蛋白的比例仅为22%，且过程繁琐直接影响终产品的产率。因此需要一种目的肽表达量高、纯化过程方便、可进行大规模生产的制备方法来获得该产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体。本专利技术的另一个目的是公开一种人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物不同拷贝数的基因串联体构建方法。本专利技术的再一个目的是公开一种用于制备该类型的人胰高血糖素样肽-2(1-35 肽)类似物的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术第一方面，提供了一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物基因串联体，其特征在于胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物的C 端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(ftx))可以重复串联形成串联体，即一个类似物C端的Asp 和先一个类似物N端的Pro形成酸水解位点，在盐酸作用下可水解为单体肽，该基因串联体氨基酸序列为Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n其中HP为一段氨基酸残基的肽链，分子量为3237Da，HP肽链序列为Asp-His-His-His-His-His-His—Gln—Thr—Cys-Pro—Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys—A rg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala ；η = 6。本专利技术第二方面，提供了一种人胰高血糖素样肽-2(1-35肽)类似物不同拷贝数的基因串联体构建方法，包括以下步骤(a)含融合伙伴 AnsB-C 的 Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)基因串联体构建一组同尾酶BamH I和Bcl I分别位于插入目的肽片段的两端，以质粒 pED-Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)为模板构建重组质粒 pED-2Pro-Pro_h GLP-2 (1-35)，再以 pED-2Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)为模板逐步构建重组质粒 pED-4Pro-Pro-hGLP-2 (1-35)、pED-6Pro-Pro_h GLP-2 (1-35)、 pED-8Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)。(b)含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h Wly2] GLP-2 (1-35)基因串联体构建在重组质粒pED-6Pro-Pro-h GLP-2 (1-3 基础上，通过 PCR 将其 396bp 的融合伙伴AnsB-C缩短为Slbp的新融合伙伴HP，构建重组质粒pET-HP-6Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)禾口 pET-HP-8Pro-Pro_h GLP-2 (1-35)。将各质粒转化coli BL21，得6种多拷贝基因串联体工程菌。 本专利技术第三方面，提供了一种用于制备该类型的人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽) 类似物的方法，包括以下步骤(a)最佳目的肽串联体筛选将各重组菌乳糖诱导表达产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测并分析，发现BL21/ pET-HP-6Pro-Pro-hGLP-2 (1-35)的目的肽表达量为 9%且最高。(b)人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物的串联体的制备将重组基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-Pro-hGLP-2 (1-35)经发酵-离心-洗涤沉淀-超声破碎-1. 2% Trition X-100提取-Ni琼脂糖凝胶层析纯化得串联体。(c)人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物的获得将串联体经酸水解-沉淀-S^hadex G_25葡聚糖凝胶层析纯化得到人胰高糖素样肽-2 (1-35肽)类似物。本专利技术的一种人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物制备方法能带来如下有益效果所表达的融合蛋白中，融合伙伴HP分子量较低使人胰高血糖素样肽-2 (1-35肽)类似物的比率为 90 %，BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)的目的肽表达量是原 BL21/ pED-Pro-Pro-h GLP-2 (1-35)的2. 7倍实现了目的肽的高表达；融合伙伴中含有六个组氨酸组成的标签便于使用M琼脂糖凝胶层析纯化使纯化操作简便；单体肽水解过程不需使用CNBr或水解酶，适合于大规模生产。附图说明图1各PCR产物凝胶电泳检测结果。图中M. DNA分子量标准，自下而上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2000bp ;1. 526bp 的 AnsB-本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种融合表达且可酸水解释放单体肽的人胰高血糖素样肽－２（１－３５肽）类似物基因串联体，其中人胰高血糖素样肽－２（１－３５肽）类似物氨基酸序列为：Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李泰明，刘涛，刘景晶，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84
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