一种T载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法技术

本发明专利技术是一种利用限制性内切酶酶切、pUCm-T载体和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列确定其3′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过选用限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex?Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体上T/A克隆位点下游的一段序列作为3′端引物；选定两条靠近未知序列端的已知DNA上的序列作为5′端引物。以pUCm-T载体连接物为模板，用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。本发明专利技术具有操作简便、应用范围广、操作限制少、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种ｐＵＣｍ－Ｔ载体介导的ＰＣＲ扩增已知ＤＮＡ序列３′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：对基因组ＤＮＡ用限制性内切酶进行双酶切；纯化的酶切产物采用Ｔａｑ酶或Ｅｘ　Ｔａｑ酶补齐和３′端加Ａ，与ｐＵＣｍ－Ｔ载体连接；利用引物设计软件选定Ｔ载体Ｔ／Ａ克隆位点下游的一段序列的互补序列作为３′端引物、两条靠近未知序列端的已知ＤＮＡ上的两段序列作为５′端引物；以ｐＵＣｍ－Ｔ载体连接物为模板，采用设计的引物进行巢式ＰＣＲ扩增；（１）ＰＣＲ引物的设计：根据已知ＤＮＡ序列设计两条５′端特异性引物，命名为Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ１和Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ２（１８－２２ｂｐ）；Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ２的３′端距待测序列要保留３０ｂｐ以上长度，它比Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ１接近待测的未知序列；针对本专利技术引入的ｐＵＣｍ－Ｔ载体，在其Ｔ／Ａ克隆位点的下游选定一条３′端特异性引物，命名为Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＲ（２０ｂｐ，Ｔｍ值５８℃）；（２）限制性内切酶的选择：根据对已知ＤＮＡ序列上限制性内切酶位点的分析，选用从Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ１到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种内切酶；本专利技术可供选择的常用的产生５′粘性末端的限制性内切酶有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅡ、ＳａｌⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＮｃｏⅠ、ＸｂａⅠ和ＸｈｏⅠ等，产生平齐末端的有ＥｃｏＲⅤ、ＳｎａＢⅠ和ＳｃａⅠ等，产生３′粘性末端的有ＢｍｔⅠ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ和ＫｐｎⅠ等；（３）ＰＣＲ模板的构建：运用步骤（２）选择的两种内切酶对基因组ＤＮＡ进行酶切，纯化的酶切产物用Ｔａｑ酶或Ｅｘ　Ｔａｑ酶进行补齐和３′端加Ａ反应，与ｐＵＣｍ－Ｔ载体连接，即可作为ＰＣＲ模板；此步骤若选用的两种内切酶都是５′粘性或平齐末端，只需选用普通Ｔａｑ酶，否则需要选用带有３′→５′外切酶活性的Ｅｘ　Ｔａｑ酶；（４）巢式ＰＣＲ扩增：以步骤（３）的ｐＵＣｍ－Ｔ连接物为模板，采用Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ１和Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＲ为引物进行第一轮ＰＣＲ扩增；再以首轮ＰＣＲ扩增产物为模板，采用Ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ２和Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＲ为引物进行第二轮ＰＣＲ扩增；将两轮ＰＣＲ（巢式ＰＣＲ）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式ＰＣＲ原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，史红玲，高金湖，谭中标，李剑芳，吴静，汪俊卿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32