番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物检疫和植物保护领域。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是包括有在容器孔中分别放置10×PCR?Buffer?1管(3)，2.5mM?dNTPs?1管(4)，5U?Taq?DNA聚合酶1管(5)，5μM上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′1管(6)，5μM下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′1管(7)，去离子水1管(12)，PBST洗液1管(8)，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管(9)，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块(10)，阳性对照1管(11)。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。
技术介绍
番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是影响番茄生产最重要的细菌性病害。该病分布广泛，在世界范围内已经广泛流行并造成了巨大的经济损失，在我国的东北、 华北、西北及东部沿海等地均有发生，部分地区产量减少在80%以上，导致我国番茄产量锐减并造成了巨大的经济损失，同时严重威胁着我国外繁种子基地的健康发展。番茄植株从幼苗到坐果期都可发病，发病的植株常表现为病苗矮化枯死、茎杆增粗溃疡、叶片坏死萎蔫、果实皱缩畸形等症状，严重影响了番茄的产量和品质，给各国番茄主要生产区造成了严重的经济损失。在苗期染病，症状初始于下部叶缘，随后向上蔓延引起整株叶片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表现为植株叶片萎蔫、下垂、卷缩，植株茎杆产生狭长稍凹陷的开裂状条斑，茎杆增粗。病菌侵染种子时，通常表现为萎蔫， 此时维管束受到严重破坏；病菌通过植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染后，则会出现叶片边缘坏死、萎蔫等局部症状；病菌侵染维管束时，则造成果实皱缩、畸形；病菌侵染果实时则出现白色圆形小点，后变黄褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色晕圈，呈“鸟眼状”。 在叶片，最初的症状是叶片出现可逆性的萎蔫，在叶片的叶脉之间产生白色随后转为褐色的坏死条斑，最后表现出永久性萎蔫，使整个植株干枯死亡。在田间，最初的症状主要是低位叶片的小叶边缘出现卷缩、下垂、凋萎、似缺水状，最后造成大片的缺株断垄，危害十分严重。番茄溃疡病远距离广泛传播最主要的途径是种子中携带的番茄溃疡病菌，有研究表明0.01%的种子传病率就能引起该病的大面积流行。更有研究表明，导致病害在田间流行并造成较大经济损失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的来源是种子带菌。至今， 尚无成功防治该病害的抗病品种和有效的药物。因此，严格控制带菌种子流入市场是防止该病暴发的最重要的措施之一。但是，番茄种子的带菌率普遍较低，一般为1%，常规的检测方法常常导致漏检。目前国内外对番茄溃疡病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELI SA检测灵敏度相对较低，且常有交叉反应，种子样品中的杂质和其他抑制剂等因素也使得PCR的检测灵敏度较低。因此，发展一种将病原富集技术和PCR高灵敏检测有效结合的方法，是出入境商用番茄种子快速检测急需解决的实际问题。
技术实现思路
本技术的目的在于避免现有技术的不足提提供一种番茄溃疡病菌快速免疫磁珠分离PCR(Immunomagnetic separation-PCR, IMS-PCR)检测试剂盒，以克服现有植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点。本技术是将免疫磁珠分离技术和分子生物学检测技术结合起来，首先利用免疫磁珠对番茄溃疡病菌进行富集，然后再利用分子生物学的高检测灵敏度，进行PCR扩增，从而建立了一种将免疫磁珠分离技术和分子生物学技术有机结合起来的检测方法。该方法检测灵敏度高、特异性强、方便快捷、能直接对带菌种子进行检测，同时省去了核酸提取的过程，降低了操作过程中病原的损失，极大地提高了检测的准确性和灵敏度，缩短了检测周期，是一种特别适用于番茄种子等植物材料中微量病原的检测方法。为实现上述目的，本技术采取的技术方案为一种番茄溃疡病菌快速 IMS-PCR检测试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫O)，在衬垫( 上设有数个容器孔，其特征是包括有在容器孔中分别放置IOXPCR Buffer 1管(3)，2. 5mM dNTPs 1管(4)，5U Taq DNA聚合酶 1 管(5)，5 μ M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 1 管(6)，5 μ M 下游引物 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 1 管(7)，去离子水 1 管，PBST 洗液 1 管(8)，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管(9)，体积为2 5mmX 2 5mmX 2 5mm的普通磁体1块(10)， 阳性对照1管(11)。上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，属于植物检疫和植物保护范畴， 本技术是属于基因水平检测，检测的基因位于16S-23S rRNA间隔区，上游引物序列为，Cmm Fl 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘，下游引物序列为，Cmm Rl 5 ‘ -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘，引物具有亚种特异性，专一针对番茄溃疡病的病原密执安棒形杆菌密执安棒形亚种。使用本技术试剂盒对参试的番茄溃疡病菌菌株进行检测，可以扩增得到270bp大小的特异性目标片段，而参试的其余非番茄溃疡病菌菌株均未扩增出特异性目标片段。同时用本试剂盒对ELISA检测为阳性的样品进行回顾性检验验证，阳性样品符合率为100%，说明本试剂盒具有较好的检测灵敏度。番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，是将免疫磁珠分离技术和PCR特异性扩增结合起来的一种新技术，该技术集病原分离富集、特异性抗体捕捉和PCR扩增于一体，是一种检测灵敏度高、检测周期短、结果准确、使用方便的植物病原检测试剂盒，尤其适用于植物保护和植物检疫部门对可能含有微量番茄溃疡病菌的样品进行快速检测。本技术试剂盒的有益效果番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，涉及到检测危险性植物病原菌的一种新技术，试剂盒提供了一种依赖免疫磁珠分离技术富集病原和PCR扩增的检测技术，克服了现有植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点，具有检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作简便快捷的优点，可以在紐内就完成整个检测过程。本试剂盒可以直接从番茄种子等植物组织中检测番茄溃疡病菌，大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。试剂盒特异性验证试验通过使用番茄溃疡病菌亚种特异性引物Cmm Fl和Cmm Rl对番茄溃疡病菌菌株和非番茄溃疡病菌菌株进行检测，结果表明引物Cmm Fl和Cmm Rl 在优化的PCR扩增条件下在番茄溃疡病菌株中扩增出了大小约270bp的特异性目标片段，而在其他7个参试的非番茄溃疡病菌菌株中均未扩增出特异性目标片段，说明本技术中使用的引物对番茄溃疡病菌具有较高的特异性。试剂盒灵敏度验证试验在梯度稀释的纯菌悬液中，本试剂盒的检测灵敏度可以达到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL ；在梯度稀释的模拟带菌种子提取液中，本试剂盒的检测灵敏度同样可以达到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL。而使用直接PCR在梯度稀释的纯菌悬液和模拟带菌种子提取液中的检测灵敏度仅为IO4CfuAiL和106cfu/mL。也即是说，本试剂盒在模拟带菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种番茄溃疡病菌快速ＩＭＳ－ＰＣＲ检测试剂盒，包括有盒体（１），衬垫（２），在衬垫（２）上设有数个容器孔，其特征是包括有在容器孔中分别放置１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　１管（３），２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　１管（４），５Ｕ　ＴａｑＤＮＡ聚合酶１管（５），５μＭ上游引物５′－ＴＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣ－３′１管（６），５μＭ下游引物５′－ＴＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣ－３′１管（７），去离子水１管（１２），ＰＢＳＴ洗液１管（８），番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠１管（９），体积为２～５ｍｍ×２～５ｍｍ×２～５ｍｍ的普通磁体１块（１０），阳性对照１管（１１）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，闵现华，
申请(专利权)人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：实用新型
国别省市：62