本发明专利技术公开一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用，包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。本发明专利技术具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。
技术介绍
养殖业中，每年约有10%的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株，易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。目前弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏手册，通过对微生物的生理生化特征进行检测来进行鉴定的，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐； 16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐， 且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，也使其应用受到限制。指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出了肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX 技术筛选溶藻弧菌适配子，并将其应用于溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本专利技术的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。本专利技术具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。 首先合成用于筛选的寡核苷酸文库(5‘ - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35 ——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG -3')，然后将该文库与溶藻弧菌混合后进行 SELEX筛选，筛选产物经克隆测序后，从中挑选出有代表性的适配子进行亲和力和特异性的验证，最终获得4条对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)。一种可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用，所述的寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途，且采用上述四条寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于溶藻弧菌的检测。所述的四条寡核苷酸序列的5'端均标记有地高辛。本专利技术的有益效果为本专利技术具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。附图说明图1为本专利技术实施例1中5条序列(5个适配子)与溶藻弧菌的亲和力比较图； 图2为本专利技术实施例1中5条序列(5个适配子)与哈维式弧菌的亲和力比较图； 图3为本专利技术实施例1中5条序列(5个适配子)与嗜水气单胞菌的亲和力比较图； 图4为本专利技术实施例1中5条序列(5个适配子)与迟钝爱德华氏菌的亲和力比较图； 图5为本专利技术实施例1中SEQ ID No. 1适配子对4种不同菌种的识别效果图6为本专利技术SEQ ID No. 2适配子对4种不同菌种的识别效果图； 图7为本专利技术SEQ ID No. 3适配子对4种不同菌种的识别效果图； 图8为本专利技术SEQ ID No. 4适配子对4种不同菌种的识别效果图。图中纵坐标均为亲和力，图1、图2、图3和图4的横坐标为适配子，图5、图6、图7、 图 8 的横坐标为微生物，K斤iidK harveyi、A. hydrophila、E. art/a 分别表示溶藻弧菌、哈维式弧菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌。具体实施例方式实施例1本实施例的一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备步骤主要包括1、合成寡核苷酸文库和引物(由上海生工生物工程技术有限公司合成)寡核苷酸文库 (SEQ ID No. 6) 5' - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC ——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG -3' (N35为35个随机寡核苷酸序列)引物 1 (Pl) 5' - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC -3' (SEQ ID No. 7) 引物 2 (P2)5' - CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC-3‘ (SEQ ID No. 8)2、SELEX筛选上面合成的寡核苷酸筛选文库先与靶目标溶藻弧菌(购自中科院微生物研究所)结合， 离心分离弧菌，再通过加热从弧菌上分离出具有亲和力ssDNA，然后通过不对称PCR扩增富集具有亲和力的ssDNA，并作为下一轮的筛选文库。重复筛选15次后，得到具有高亲和力的 4 条适配子文库(SEQ ID No. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4)。相应的具体步骤说明如下1)溶藻弧菌菌液制备用蒸馏水将培养M h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000 rpm离心5 min，弃上清液。用蒸馏水重悬并稀释菌液到下列浓度范围1 X108f/mL至9X108个/mL。然后取菌液分装20管，每管1 mL的菌液。-20 ！低温保存备用。2)与弧菌结合取上述由上海生工生物工程技术有限公司化学合成的100 μ M ssDNA 4 111^，用2父结合缓冲液(20X 结合缓冲液配方1 M NaCl,50 mM KCl,500 mM Tris-HClUO mM MgCl2、pH 7. 4。用时用蒸馏水稀释10倍)稀释至100 yL,95 °C变性5 min，迅速冷却到4 °C, 10 min 后加入100 PL自然室温恢复的菌液，再加入200 μ L生理盐水，摇床结合30 min。然后 6000 rpm离心5 min，弃上清，然后用IX结合缓冲液(将20X结合缓冲液稀释20倍，(配方同上))洗沉淀3次，弃上清。则沉淀部分为弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA。3)分离结合的ssDNA在上述沉淀加入IX结合缓冲液(配方同上)100 UL, 96 °C加热5 min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后6000 rpm离心10 min,取上清液，再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA。4)不对称 PCR 扩增 ssDNA 不对称PCR扩增体系(40 μ L反应体积) 10XPCR缓冲液4 μ L (本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，其特征在于：包括ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑江，郝聚敏，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：92
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