本发明专利技术涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ?ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ?ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ，Ｃｍｍ）的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。一种番茄溃疡病菌快速ＩＭＳ－ＰＣＲ检测试剂盒，其主要特点是包括有１０×ＰＣＲ?Ｂｕｆｆｅｒ?１管，２．５ｍｍ?ｄＮＴＰｓ?１管，５Ｕ?Ｔａｑ?ＤＮＡ聚合酶１管，５μｍ上游引物５′－ＴＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣ－３′２００μｌ，５μｍ下游引物５′－ＴＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣ－３′２００μｌ，去离子水１管，ＰＢＳＴ洗液１管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠１管，普通磁体１块，阳性对照１管。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物 检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫 及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。
技术介绍
番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是影响番茄生产最重要的细菌性病 害。该病分布广泛，在世界范围内已经广泛流行并造成了巨大的经济损失，在我国的东北、 华北、西北及东部沿海等地均有发生，部分地区产量减少在80%以上，导致我国番茄产量锐 减并造成了巨大的经济损失，同时严重威胁着我国外繁种子基地的健康发展。番茄植株从幼苗到坐果期都可发病，发病的植株常表现为病苗矮化枯死、茎杆增 粗溃疡、叶片坏死萎蔫、果实皱缩畸形等症状，严重影响了番茄的产量和品质，给各国番茄 主要生产区造成了严重的经济损失。在苗期染病，症状初始于下部叶缘，随后向上蔓延引 起整株叶片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表现为植株叶片萎蔫、下垂、卷 缩，植株茎杆产生狭长稍凹陷的开裂状条斑，茎杆增粗。病菌侵染种子时，通常表现为萎蔫， 此时维管束受到严重破坏；病菌通过植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染后，则会出现叶 片边缘坏死、萎蔫等局部症状；病菌侵染维管束时，则造成果实皱缩、畸形；病菌侵染果实 时则出现白色圆形小点，后变黄褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色晕圈，呈“鸟眼状”。 在叶片，最初的症状是叶片出现可逆性的萎蔫，在叶片的叶脉之间产生白色随后转为褐色 的坏死条斑，最后表现出永久性萎蔫，使整个植株干枯死亡。在田间，最初的症状主要是低 位叶片的小叶边缘出现卷缩、下垂、凋萎、似缺水状，最后造成大片的缺株断垄，危害十分严 重。番茄溃疡病远距离广泛传播最主要的途径是种子中携带的番茄溃疡病菌，有研究 表明0.01%的种子传病率就能引起该病的大面积流行。更有研究表明，导致病害在田间流 行并造成较大经济损失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的来源是种子带菌。至今， 尚无成功防治该病害的抗病品种和有效的药物。因此，严格控制带菌种子流入市场是防止 该病暴发的最重要的措施之一。但是，番茄种子的带菌率普遍较低，一般为1 %，常规的检测 方法常常导致漏检。目前国内外对番茄溃疡病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培 养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足 多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，且常有交叉反应， 种子样品中的杂质和其他抑制剂等因素也使得PCR的检测灵敏度较低。因此，发展一种将 病原富集技术和PCR高灵敏检测有效结合的方法，是出入境商用番茄种子快速检测急需解 决的实际问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足提提供一种番茄溃疡病菌快速免疫磁珠 分离PCR(Immunomagnetic separation-PCR, IMS-PCR)检测试剂盒，以克服现有植物病原菌 检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点。本专利技术是将免疫磁珠分离技术和分子生 物学检测技术结合起来，首先利用免疫磁珠对番茄溃疡病菌进行富集，然后再利用分子生 物学的高检测灵敏度，进行PCR扩增，从而建立了一种将免疫磁珠分离技术和分子生物学 技术有机结合起来的检测方法。该方法检测灵敏度高、特异性强、方便快捷、能直接对带菌 种子进行检测，同时省去了核酸提取的过程，降低了操作过程中病原的损失，极大地提高了 检测的准确性和灵敏度，缩短了检测周期，是一种特别适用于番茄种子等植物材料中微量 病原的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检 测试剂盒，其主要特点是包括有10XPCR Buffer 1管，2. 5mM dNTPsl管，5U Taq DNA聚合 酶 1 管，5 ii M 上游引物 5 ‘ -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 200u L,5uM 下游引物 5 ‘ -TA CTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 200 u L，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免 疫磁珠1管，体积为2 5_X 2 5_X 2 5_的普通磁体1块，阳性对照1管。所述的免疫磁珠购买于Promega公司。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为(1)病菌富集取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50 PL 番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为105-106个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为 150rpm，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小 心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去 洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50iiL去离子水中，离心混 勻后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C热裂解15min，然后迅速转移到冰 上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6yL转移至另一 PCR管中，再在 该管内加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 ii L，5 ii M 下游弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 ii L，扩增条件为 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4°C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。(3)结果分析灌制1.5%琼脂糖凝胶，取10yL PCR产物进行电泳分离，在凝胶成 像系统下进行拍照并分析，若阳性对照和检测样品在270bp处可见特异性目标条带，阴性 对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其主要 特点是步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，调整 生物素浓度为50 u g/mL ；(2)测定抗体的浓度，并用pH为9. 6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 u g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;(4)将透析孔径为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在500mL 2%的NaHC03和lmmol/L pH为8. 0的Na2EDTA 2H20中将透析膜煮沸lOmin,再用去离子 水彻底清洗透析膜，然后放于lmmol/L Na2EDTA -2H20中将之煮沸lOmin，冷却后放于4°C冰 箱，确保透析膜始终浸没在溶液内，最后用去离子水将透析膜内外冲洗干净，结扎透析膜的 一端后将生物素化的抗体移入透析袋中，然后再结扎透析袋的另一端，放于2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种番茄溃疡病菌快速ＩＭＳ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征是包括有１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ １管，２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １管，５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１管，５μＭ上游引物５′－ＴＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣ－３′２００μＬ，５μＭ下游引物５′－ＴＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣ－３′２００μＬ，去离子水１管，ＰＢＳＴ洗液１管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠１管，体积为２～５ｍｍ×２～５ｍｍ×２～５ｍｍ的普通磁体１块，阳性对照１管。
【技术特征摘要】
一种番茄溃疡病菌快速IMS PCR检测试剂盒，其特征是包括有10×PCRBuffer 1管，2.5mM dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上游引物5′ TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 3′200μL，5μM下游引物5′ TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3′200μL，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块，阳性对照1管。2.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1)病菌富集取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50y L番茄溃 疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为105_106个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm，然 后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检 测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于5 0 y L去离子水中，离心混勻 后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C热裂解15min，然后迅速转移到冰上 冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 y L转移至另一 PCR管中，再在该 管内加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 ii L，5 ii M 下游弓 | 物 5 ' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 u L,扩增条件为 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4。C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。3.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其特征是 步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶于二甲基甲酰胺中，调整生物素浓度为50yg/mL ；(2)测定抗体的浓度，并用pH为9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 u g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;(4)将透析分子量为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在500mL 2 %的NaHC03和lmmol/L pH...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，闵现华，
申请(专利权)人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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