【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物 检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫 及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。
技术介绍
番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是影响番茄生产最重要的细菌性病 害。该病分布广泛，在世界范围内已经广泛流行并造成了巨大的经济损失，在我国的东北、 华北、西北及东部沿海等地均有发生，部分地区产量减少在80%以上，导致我国番茄产量锐 减并造成了巨大的经济损失，同时严重威胁着我国外繁种子基地的健康发展。番茄植株从幼苗到坐果期都可发病，发病的植株常表现为病苗矮化枯死、茎杆增 粗溃疡、叶片坏死萎蔫、果实皱缩畸形等症状，严重影响了番茄的产量和品质，给各国番茄 主要生产区造成了严重的经济损失。在苗期染病，症状初始于下部叶缘，随后向上蔓延引 起整株叶片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表现为植株叶片萎蔫、下垂、卷 缩...
【技术保护点】
一种番茄溃疡病菌快速ＩＭＳ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征是包括有１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ １管，２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １管，５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１管，５μＭ上游引物５′－ＴＣＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣ－３′２００μＬ，５μＭ下游引物５′－ＴＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣ－３′２００μＬ，去离子水１管，ＰＢＳＴ洗液１管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠１管，体积为２～５ｍｍ×２～５ｍｍ×２～５ｍｍ的普通磁体１块，阳性对照１管。
【技术特征摘要】
一种番茄溃疡病菌快速IMS PCR检测试剂盒，其特征是包括有10×PCRBuffer 1管，2.5mM dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上游引物5′ TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 3′200μL，5μM下游引物5′ TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3′200μL，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块，阳性对照1管。2.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1)病菌富集取检测样品lmL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50y L番茄溃 疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为105_106个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm，然 后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检 测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液；(2)PCR扩增将富集病菌后的免疫磁珠重悬于5 0 y L去离子水中，离心混勻 后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99°C热裂解15min，然后迅速转移到冰上 冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36. 6 y L转移至另一 PCR管中，再在该 管内加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上游引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 ‘ 2 ii L，5 ii M 下游弓 | 物 5 ' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 ‘ 2 u L,扩增条件为 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35个循环，然后72°C延伸7min，最后4。C保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的 特异性目标片段。3.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其特征是 步骤为(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶于二甲基甲酰胺中，调整生物素浓度为50yg/mL ；(2)测定抗体的浓度，并用pH为9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10 u g/mL ；(3)按生物素与抗体的质量比为1 10的比例混合，室温振荡反应4h;(4)将透析分子量为8000-14000的透析膜剪成长度为5-lOcm的小段，然后在500mL 2 %的NaHC03和lmmol/L pH...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，闵现华，
申请(专利权)人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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