苜蓿花叶病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

一种苜蓿花叶病毒real‑time RT‑PCR检测试剂盒，包括以下组分：RT‑PCR buffer，2×RT‑PCR buffer，40‑250μL；Ex Taq HS 5U/μL，1.5‑20μL；Prime Script RT Enzyme Mix，1.5‑20μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，1.5‑30μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，1.5‑30μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，1.5‑30μL；无RNA酶的去离子水，20μL‑1mL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照6‑60μL。利用本发明专利技术检测方法能特异扩增出苜蓿花叶病毒的基因片段，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，检测周期短。

【技术实现步骤摘要】
苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，涉及一种苜蓿病害的检测方法，主要针对苜蓿花叶病毒的检测。
技术介绍
由苜蓿花叶病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）引起的花叶病，首次报道于1931年，目前在世界各地都有发生。苜蓿花叶病毒属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）苜蓿花叶病毒属（Alfamovirus）的确定种。该病毒寄主范围广，自然发生在许多草本和木本植物上，能侵染51个科的430种双子叶植物，其中具有经济价值的重要寄主有苜蓿、马铃薯、大豆、豇豆、赤豆、绿豆、草木樨、三叶草、野豌豆、羽扇豆、香豌豆、鹰嘴豆、豌豆、蚕豆、小扁豆、菜豆、烟草、辣椒、番茄、啤酒花和芹菜等。苜蓿花叶病毒可通过蚜虫、汁液、花粉和种子进行传播，种子是远距离传播的主要途径。该病毒在苜蓿、大豆、辣椒上可种传。苜蓿种传率10%，辣椒种传率1%～5%，假酸浆种传率23%。病毒在苜蓿种子内至少存活10年，种子带毒率0～10%，一般为2%～4%。该病毒可与其它病毒混合侵染，影响作物产量，造成严重的经济损失。实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术完全闭管扩增和检测，无须PCR的后处理，可有效地防范PCR扩增物的污染，通过荧光PCR检测仪自动收集和分析数据，无须人工判断，观察结果可靠。该技术可实现对DNA/RNA模板的定量，具有灵敏度和特异性高、能进行多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究领域。建立苜蓿花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法，可用于携带有苜蓿花叶病毒的种子、苗木、繁殖材料及其产品的检测，及时、快速、准确地检测苜蓿花叶病毒，防止其随种子苗木扩散传播，为农业生产安全提供技术保障。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，检测病原为苜蓿花叶病毒。本专利技术的又一目的提供一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测方法，适合种子、苗木、繁殖材料中苜蓿花叶病毒的测定。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，检测病原为苜蓿花叶病毒，包括以下组分：RT-PCRbuffer，2×RT-PCRbuffer，40-250μL；ExTaqHS5U/μL，1.5-20μL；PrimeScriptRTEnzymeMix，1.5-20μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，1.5-30μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，1.5-30μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，1.5-30μL；无RNA酶的去离子水，20μL-1mL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照6-60μL。RT-PCR扩增引物和探针为：苜蓿花叶病毒AMV上游引物为：5′-GCTACAGGAGAGTTAGTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV下游引物为：5′-GACAGCAGAGTTCATATTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV探针序列为：5′-TGTTGACACCGACCATGATGCTA-3′。一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测方法，具体为：1）待测样品RNA提取；2）RT-PCR反应体系为20μL，其中2×onestepRT-PCRbuffer10μL，ExTaqHS5U/μL0.4μL，PrimeScriptRTEnzymeMix0.4μL，苜蓿花叶病毒AMV上下游引物10μmol/L各0.4μL，苜蓿花叶病毒AMVprobe10μmol/L0.8μL，总RNA模板2μL，无RNA酶的去离子水；3）RT-PCR反应条件为：cDNA合成：42℃5min，1个循环；PCR扩增：95℃10s；95℃5s，59℃34s，40个循环；4）采用实时荧光PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的Ct值判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品中含有AMV核酸。本专利技术根据AMV的保守序列区设计了检测引物和探针，建立了实时荧光RT-PCR反应体系和反应程序。有益效果：本专利技术能检测苜蓿花叶病毒，检测周期短。利用该检测方法能特异扩增出苜蓿花叶病毒的基因片段，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，可用于AMV的早期诊断和田间病原调查，实现了苜蓿花叶病毒病的高效快速检测，有利于摸清田间病害发生状况，可为苜蓿健康生产提供有效的监控手段，还对苜蓿其它病原的检测具有一定的参考价值。附图说明图1为本专利技术real-timeRT-PCR扩增曲线；图中：①:苜蓿花叶病毒；②:阴性对照；图2为本专利技术real-timeRT-PCR灵敏度扩增曲线；图中：①:苜蓿花叶病毒RNA抽提液；②:101倍梯度稀释；③:102倍梯度稀释；④:103倍梯度稀释；⑤:104倍梯度稀释；⑥:105倍梯度稀释；图3为本专利技术感病样品进行real-timeRT-PCR检测的扩增曲线；图中：①:感染苜蓿花叶病毒的苜蓿样品；②:水对照。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。所述
的普通技术人员依据以上本专利技术公开的内容和各参数所取范围，均可实现本专利技术的目的。实施例1：一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，检测病原为苜蓿花叶病毒，其包括以下组分：RT-PCRbuffer，2×RT-PCRbuffer，250μL；ExTaqHS5U/μL，20μL；PrimeScriptRTEnzymeMix，20μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，30μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，30μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，30μL；无RNA酶的去离子水，1mL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照60μL。RT-PCR扩增引物和探针为：苜蓿花叶病毒AMV上游引物为：5′-GCTACAGGAGAGTTAGTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV下游引物为：5′-GACAGCAGAGTTCATATTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV探针序列为：5′-TGTTGACACCGACCATGATGCTA-3′。实施例2：一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，苜蓿病原为苜蓿花叶病毒，其包括以下组分：RT-PCRbuffer，2×RT-PCRbuffer，40μL；ExTaqHS5U/μL，1.5μL；PrimeScriptRTEnzymeMix，1.5μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，1.5μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，1.5μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，1.5μL；无RNA酶的去离子水，20μL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照6μL。RT-PCR扩增引物和探针为：苜蓿花叶病毒AMV上游引物为：5′-GCTACAGGAGAGTTAGTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV下游引物为：5′-GACAGCAGAGTTCATATTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV探针序列为：5′-TGTTGACACCGACCATGATGCTA-3′。实施例3：一种苜蓿花叶病毒real-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苜蓿花叶病毒real‑time RT‑PCR检测试剂盒，病原为苜蓿花叶病毒，其特征在于包括以下组分：RT‑PCR buffer，2×RT‑PCR buffer，40‑250μL；Ex Taq HS，1.5‑20μL；Prime Script RT Enzyme Mix，1.5‑20μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，1.5‑30μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，1.5‑30μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，1.5‑30μL；无RNA酶的去离子水，20μL‑1mL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照6‑60μL；RT‑PCR扩增引物和探针为：苜蓿花叶病毒AMV上游引物为：5′‑GCTACAGGAGAGTTAGTG‑3′；苜蓿花叶病毒AMV下游引物为：5′‑GACAGCAGAGTTCATATTG‑3′；苜蓿花叶病毒AMV探针序列为：5′‑TGTTGACACCGACCATGATGCTA‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种苜蓿花叶病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒，病原为苜蓿花叶病毒，其特征在于包括以下组分：RT-PCRbuffer，2×RT-PCRbuffer，40-250μL；ExTaqHS，1.5-20μL；PrimeScriptRTEnzymeMix，1.5-20μL；苜蓿花叶病毒AMV上游引物，浓度为10μmol/L，1.5-30μL；苜蓿花叶病毒AMV下游引物，浓度为10μmol/L，1.5-30μL；苜蓿花叶病毒AMV探针10μmol/L，1.5-30μL；无RNA酶的去离子水，20μL-1mL；苜蓿花叶病毒AMV无侵染活性的阳性对照6-60μL；RT-PCR扩增引物和探针为：苜蓿花叶病毒AMV上游引物为：5′-GCTACAGGAGAGTTAGTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV下游引物为：5′-GACAGCAGAGTTCATATTG-3′；苜蓿花叶病毒AMV探针序列为：5′-TGTTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：文朝慧，周小平，李儒，王军平，王溪桥，尤佳，满岳，左佳妮，
申请(专利权)人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：发明
国别省市：甘肃,62