一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种2‑8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，包括qRT‑PCR反应液、qRT‑PCR启动剂、RNA内对照，强阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品及定量参考品；其中qRT‑PCR反应液中包括qRT‑PCR增强剂、反应缓冲液、2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、1条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、2条检测RNA内对照的特异性引物、1条检测RNA内对照的特异性探针、双功能DNA聚合酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、0.1%叠氮化钠。本发明专利技术试剂盒灵敏度高（最低可检测HCV病毒10IU/ml）、特异性好、精密度高、定量准确、线性范围广的，检测方法简单且所需时间短，对于丙型肝炎病毒核酸的临床快速检测具有很高的参考价值，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒
本专利技术涉及体外诊断
，尤其是涉及一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒。
技术介绍
丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，目前可分为6个基因型和多个亚型，HCV感染引起的丙型病毒性肝炎呈全球性流行。慢性丙型病毒性肝炎可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题，丙型肝炎病毒的核酸检测为丙型肝炎的临床诊治提供了有效的方法。目前HCV的核酸检测方法主要基于实时荧光逆转录聚合酶连反应(qRT-polymerasechainreaction，qRT-PCR)，采用逆转录酶和DNA聚合酶进行。由于逆转录酶热稳定性较差，因此检测试剂通常保存于-20℃冷冻条件下，呈固体状态，使用时再对试剂进行解冻，操作不便，延长了检测用时，且多次冻融对试剂的检测性能有一定影响；而且冷冻保存的试剂对运输条件要求高，进一步增加了检测成本。目前市面上仅有罗氏公司的丙型肝炎病毒核酸检测试剂为2-8℃液体状态保存，虽操作较为方便，但核酸提取加核酸扩增检测需4.5小时才能完成，费时较长。截止目前尚未有2-8℃保存且具有快速检测能力的丙型肝炎病毒核酸检测试剂问世。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，不仅方便存储及运输，同时还能大大缩短检测时间。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，包括qRT-PCR反应液、qRT-PCR启动剂、RNA内对照，强阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品及定量参考品；所述qRT-PCR反应液中包括qRT-PCR增强剂、反应缓冲液、2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、1条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、2条检测RNA内对照的特异性引物、1条检测RNA内对照的特异性探针、双功能DNA聚合酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、0.1%叠氮化钠。其中所述的qRT-PCR增强剂为由1%-10%DMSO、200-500mM甜菜碱、0.01%-0.05%Tween20和1%-10%甘油配制的混合物。所述的反应缓冲液是由50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(pH8.3)和100mM乙酸钾组成。所述2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物的浓度为0.3~0.9uM，所述一条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针的浓度为0.1~0.3uM，其碱基序列分别为：靶引物1（SEQIDNo.1）：5'-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'，靶引物2（SEQIDNo.2）：5'-AAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'；靶探针（SEQIDNo.5）：FAM-CGGAACCGGTGAGTACACCGGAAT-BHQ1。所述2条检测RNA内对照的特异性引物的浓度为0.3~0.9uM，所述1条检测RNA内对照的特异性探针的浓度为0.1~0.3uM；其碱基序列分别为：内对照引物1（SEQIDNo.3）：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3'，内对照引物2（SEQIDNo.4）：5'-CTGAAGAACTTGCGTTCTCG-3'；内对照探针（SEQIDNo.6）：ROX-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-BHQ2。所述双功能DNA聚合酶为rTthDNA聚合酶，其含量为5-10U。所述qRT-PCR启动剂为1-3mMMn(OAc)2和0.1%叠氮化钠。所述RNA内对照为人工设计的一段核苷酸序列制备的RNA假病毒溶液；其核苷酸序列为（SEQIDNo.7）：5'-ggctgctcgcggatacccgtacctcgggtttccgtcttgctcgtatcgctcgagaacgcaagttcttcagcgaaaagcacgacagtggtcgctacatagcgtggttccatactggaggtgaaatcaccgacagcatgaattccgccggcgtgcgcgttatacgcacttcggagtggctaacgccggttcccacattccctca-3'。所述阴性质控品为不含丙型肝炎病毒核酸或不含丙型肝炎病毒的血清或血浆；所述强阳性质控品、弱阳性质控品及定量参考品为根据丙型肝炎病毒5’UTR区的核酸序列制备的假病毒颗粒，经不含丙型肝炎病毒核酸或不含丙型肝炎病毒的血清或血浆稀释至不同浓度梯度得到，其核酸序列为（SEQIDNo.8）：5'-gtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgctt-3'。本专利技术的一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的方法，采用本专利技术制备的试剂盒，具体步骤包括：第一步，模板RNA的提取提取和纯化临床血清或血浆样本中的丙型肝炎病毒核酸，并在其中添加RNA内对照，浓度为1.0E+03-1.0E+04copies/ml；第二步，阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品及定量参考品A、B、C、D与样本同步进行模板RNA的提取和纯化阴性质控品，为不含丙型肝炎病毒核酸的血清或血浆，外观澄清；强阳性质控品，使用不含丙型肝炎病毒核酸的血清或血浆对丙型肝炎假病毒颗粒进行稀释，其浓度为1.0E+04-1.0E+06IU/ml；（采用WHO定量标准品进行定量），弱阳性质控品，使用不含丙型肝炎病毒核酸的血清或血浆对丙型肝炎假病毒颗粒进行稀释，其浓度为5.0E+01-1.0E+03IU/ml（采用WHO定量标准品进行定量）；定量参考品A、B、C、D，使用不含丙型肝炎病毒核酸的血清或血浆对丙型肝炎假病毒颗粒进行10倍梯度稀释，使其浓度在1.0E+02-1.0E+08IU/ml之间（采用WHO定量标准品进行定量），每个相邻的定量参考品之间浓度相差大约100倍；第三步，qRT-PCR反应在200µlPCR管内配制反应体系：qRT-PCR反应液20ul、qRT-PCR启动剂10ul，模板RNA40-60ul；将上述反应管于以下条件进行荧光定量PCR反应：第四步，结果判读强阴性质控应FAM通道NoCt，ROX通道Ct值≤35.0，强阳性质控检测浓度应在1.0E+04-1.0E+06IU/mL范围内，弱阳性质控检测浓度应在5.0E+01-1.0E+03IU/mL范围内，在满足以上3个条件下，荧光定量PCR仪即可根据4个浓度梯度定量参考品绘制的校准曲线自动生成待测样本的检测浓度结果。本专利技术的优点在于在反应液中添加了qRT-PCR增强剂（由DMSO、甜菜碱、Tween20和甘油组成的混合物），该增强剂作为一种渗透保护剂，能够防止双功能DNA聚合酶的变性，增强了qRT-PCR反应液的稳定性，可实现检测试剂盒在2-8℃条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种2‑8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：包括qRT‑PCR反应液、qRT‑PCR启动剂、RNA内对照，强阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品及定量参考品；所述qRT‑PCR反应液中包括qRT‑PCR增强剂、反应缓冲液、2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、1条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、2条检测RNA内对照的特异性引物、1条检测RNA内对照的特异性探针、双功能DNA聚合酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、0.1%叠氮化钠。

【技术特征摘要】
1.一种2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：包括qRT-PCR反应液、qRT-PCR启动剂、RNA内对照，强阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品及定量参考品；所述qRT-PCR反应液中包括qRT-PCR增强剂、反应缓冲液、2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、1条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、2条检测RNA内对照的特异性引物、1条检测RNA内对照的特异性探针、双功能DNA聚合酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、0.1%叠氮化钠。2.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述qRT-PCR增强剂为由1%-10%DMSO、200-500mM甜菜碱、0.01%-0.05%Tween20和1%-10%甘油配制的混合物。3.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液由50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸和100mM乙酸钾组成。4.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述2条检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物的浓度为0.3~0.9uM，所述一条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针的浓度为0.1~0.3uM，其碱基序列分别为：靶引物1：5'-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'，靶引物2：5'-AAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'；靶探针：FAM-CGGAACCGGTGAGTACACCGGAAT-BHQ1。5.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述2条检测RNA内对照的特异性引物的浓度为0.3~0.9uM，所述1条检测RNA内对照的特异性探针的浓度为0.1~0.3uM；其碱基序列分别为：内对照引物1：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3'，内对照引物2：5'-CTGAAGAACTTGCGTTCTCG-3'；内对照探针：ROX-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-BHQ2。6.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述双功能DNA聚合酶为rTthDNA聚合酶，其含量为5-10U。7.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述qRT-PCR启动剂为1-3mMMn(OAc)2和0.1%叠氮化钠。8.根据权利要求1所述的2-8℃保存的快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述RNA内对照为人工设计的一段核苷酸序列制备的RNA假病毒溶液；其核苷酸序列为：5'-ggctgctcgcggatacccgtacctcgggtttccgtcttgctcgtatcgctcgagaacgcaagttcttcagcgaaaagcacgacagtggtcgctacatagcgtggttccatactggaggtgaaatcacc...

【专利技术属性】
技术研发人员：王义聪，李振红，杜美，鲁清月，付光宇，吴学炜，苗拥军，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41