基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组以及试剂盒，属于分子生物学技术领域，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物对和探针；所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术提供的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，能在5～15min内检测出西尼罗病毒RNA。

【技术实现步骤摘要】
基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒。
技术介绍
西尼罗病毒(WestNilevirus，WNV)病是一种烈性人畜共患疾病，1937年在乌千达北部尼罗河地区首先发现而得名。近年来西尼罗病毒感染在欧洲、中东、西亚和俄罗斯等地区和国家频频发生，成为近年来影响美国最大的传染病。西尼罗病毒是经库蚊等嗜鸟蚊传播，以鸟类为主要动物宿主的黄病毒。人、马和其他哺乳动物在被西尼罗病毒感染的蚊虫叮咬后而发病，轻者出现发热、头痛等流感样症状(西尼罗热)，重者可表现为中枢神经系统症状(西尼罗脑炎)，甚至死亡。西尼罗病毒属于黄病毒科黄热病毒属，与乙型脑炎，圣路易脑炎，黄热病，登革热，日本脑炎，丙型肝炎等病毒同属，有囊膜，单链线形核糖核酸，RNA为正链，约有10000～11000个碱基对，具有感染性。电镜下该病毒呈中等大小，直径21nm～60nm，圆形颗粒，对有机溶剂，紫外线敏感。近年来，由于国际合作的加深，各国间贸易往来频繁，旅行者数量逐年递增，这些都增大了西尼罗病毒传入我国的可能性。因此，在国境口岸建立该病毒的快速检验方法，并应用于口岸西尼罗病毒的监测工作，对防治该病传入我国具有重要意义。西尼罗病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serumneutra1izationtest，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-1inked1munosorbentassays，ELISA)、PCR检测等病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但西尼罗病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行；血清中和试验(Serumneutralizationtest，SNT)和酶联免疫吸附检验(Enzyme-1inkedimmunosorbentassays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高，PCR检测具有快速，准确的特点，也被广泛用于对西尼罗病毒的检测，如聚合酶链式反应(RT-PCR)以及等温核酸技术中的RT-LAMP法，大大缩短了检测的时间。以RT-PCR技术为代表如多重RT-PCR、RT-巢式PCR以及实时定量RT-PCR以其高度的特异性及敏感性在西尼罗病毒检测方面取得了重大的突破，但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。等温核酸技术中的RT-LAMP方法克服了RT-PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但是，RT-LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性率也比较高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒，实现西尼罗病毒的简单、快速和灵敏的现场检测。基于上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQIDNo.2所述的核苷酸序列，所述探针具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。优选的，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。优选的，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。优选的，所述荧光猝灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。本专利技术还提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物探针组；所述引物探针组中的引物对和探针以混合溶液的形式存在。优选的，所述引物对中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.2mM。优选的，所述探针的浓度为0.01～0.03mM。优选的，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为200mM的Tris-HCl缓冲液、浓度为260mM的MgAc和质量分数为20％的PEG20000。优选的，所述阳性质控品中包括西尼罗病毒的基因组DNA；所述西尼罗病毒的基因组DNA的浓度为1×104Copies/μl。优选的，所述阴性质控品为ddH2O或纯化。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，能够在样本中西尼罗病毒浓度较低的情况下，快速、准确的实现西尼罗病毒的RNA扩增。本专利技术提供的基于RAA荧光法检测西尼罗病毒试剂盒，能方便快速准确地鉴定西尼罗病毒，操作简便，检测时间短，15min内完成检测；无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，可实现在恒温30～42℃下进行等温扩增即可完成检测，对设备要求低。也无需像LAMP技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增(容易产生假阳性)；引物序列少，假阳性低。利用本专利技术提供的试剂盒检测西尼罗病毒的方法速度快、通量高，降低了检测时间和检测成本，研究表明本专利技术提供的基于RAA荧光法快速检测西尼罗病毒的试剂盒，检测西尼罗病毒时与其他虫媒传染病乙脑、登革热病、黄热、基孔肯雅无交叉反应，特异性强，特异性达100％；灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10Copies。本专利技术提供的基于RAA荧光法快速检测西尼罗病毒的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。附图说明图1为不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果；图2为西尼罗病毒质粒DNA重复性检测结果；图3为西尼罗病毒的特异性检测结果。具体实施方式本专利技术提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列：cacagatgtcatcacgattccaacagctgc；所述下游序列具有如SEQIDNo.2所述的核苷酸序列：cttctggatcattaccagccgacagcactg。在本专利技术中，所述引物序列是根据西尼罗病毒高度保守序列设计获得；所述西尼罗病毒高度保守序列如SEQIDNo.4所示：ctctaacttccaagggaaggtgatgatgacggtaaatgctactgacgtcacagatgtcatcacgattccaacagctgctggaaagaacctatgcattgtcagagcaatggatgtgggatacatgtgcgatgatactatcacttatgaatgcccagtgctgtcggctggtaatgatccagaagacatcgactgttggtgcacaaagtcagcagtctacgtcaggtatggaagatgcaccaagacacgccac。在本专利技术中所述西尼罗病毒高度保守序列是根据西尼罗病毒(WestNilevirus，WNV)的全基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有如SEQIDNo.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQIDNo.2所述的核苷酸序列，所述探针具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。4.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光猝灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCY...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑伟，王刚，麻慧君，杨永耀，吴忠华，郭利川，汤赛君，王智宏，应清界，
申请(专利权)人：浙江国际旅行卫生保健中心浙江出入境检验检疫局口岸门诊部，江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33