本发明专利技术公开了一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，该引物组的特异性强，敏感性高。本发明专利技术还公开了一种猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）合成上述的用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组；（2）提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；（3）电泳分析PCR扩增产物。该多重PCR检测方法简便、快速、经济、高效，可以大大节约检测时间，提高检测效率。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒（porcinecircovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强。即便在pH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。常见的PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。因此现有的PCV检测主要集中在PCV1和PCV2。2016年美国首次从流产胎儿体内鉴定出PCV3（PalinskiR,PineyroP,ShangP,etal.ANovelPorcineCircovirusDistantlyRelatedtoKnownCircovirusesIsAssociatedwithPorcineDermatitisandNephropathySyndromeandReproductiveFailure[J].JVirol,2016,91(1):1879-16）。我国已有13个省猪场存在PCV3的感染与流行（KuX,ChenF,LiP,etal.Identificationandgeneticcharacterizationofporcinecircovirustype3inChina[J].TranboundEmergDis,2017,64(3):703-708），PCV3是引起母猪流产的新型病原之一。猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)感染引起的一种以母猪流产为主要特征的烈性传染病。PRV属于疱疹病毒科，疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型，病毒例子直径为110-120nm，基因组为线状双链DNA，大小约150kb。PRV保存的最适PH为6-8，100℃可以存活1分钟。由于PCV3和PRV野毒感染在临床中感染猪以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。因此，建立一种能够快速区分PCV3型和PRV的多重PCR检测方法和试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于检测猪圆环病毒3型（PCV3）和猪伪狂犬病毒野毒株（PRV野毒）的引物组和试剂盒及其检测方法。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，其中，所述用于检测猪圆环病毒3型的引物的核苷酸序列为：上游引物L1：5ˊ-TAGTATTACCCGGCACCTCGGA-3ˊ（SEQIDNO.1），下游引物L2：5ˊ-GAACCCTCAGAGGGTACCTGT-3ˊ（SEQIDNO.2）；所述用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物的核苷酸序列为：上游引物L3：5ˊ-ATGCGGCCCTTTCTGCTG-3ˊ（SEQIDNO.3），下游引物L4：5ˊ-GCAGGACGCTCAGGTGCG-3ˊ（SEQIDNO.4）。上述用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组能够用于制备检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株的试剂。本专利技术还提供了一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒的成分组成包括：DNA提取试剂、PCR扩增试剂；其中，所述PCR扩增试剂包括：PCR扩增缓冲液、dNTP、上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4、TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水；所述上游引物L1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物L1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述上游引物L2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述上游引物L3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述下游引物L4的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的成分组成还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪圆环病毒3型的基因组DNA和猪伪狂犬病毒野毒株的基因组DNA；所述阴性对照为无菌双蒸水。上述的试剂盒可以用于检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株。本专利技术还提供了一种猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）引物合成：合成上述的用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组；（2）PCR扩增：提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；（3）分析PCR扩增产物：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（琼脂糖凝胶电泳的电压为100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察电泳结果）。根据上述的多重PCR检测方法，优选地，步骤（2）中所述PCR扩增反应的反应体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μl，2.5pmol/L的dNTP4.0μl，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4各1.0μl，DNA模板3.0μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl，无菌双蒸水补至50.0μl；其中，上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3和下游引物L4的浓度（初始浓度）均为25pmol/L。根据上述的多重PCR检测方法，优选地，步骤（2）中所述PCR扩增反应反应条件为：95℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，共33个循环；72℃10min。本专利技术取得的积极有益效果：（1）本专利技术根据GenBank中收录的猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的序列，通过比对PCV3和PRV野毒之间的差异，设计了检测PCV3和PRV野毒的特异性引物组，与现有技术相比，本专利技术的引物组具有很强的敏感性，对PCV3和PRV野毒的最低检测量分别为1.0×10-7ng/μL和1.2ng/ml。（2）本专利技术设计的用于检测PCV3和PRV野毒的引物组的特异性强，对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒均为阴性；该引物组的重复性好，对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达95%以上。（3）本专利技术猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的多重PCR检测方法不仅具有单个PCR的特异性、敏感性、准确性，而且检测结果准确，可以在一个反应体系里能同时检测出猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株两种病毒，简便、快速、经济、高效，省时省力，使原来需要做两次PCR和两次电泳的检测，现在一次就可以完成，大大缩短了检测时间，提高检测效率，而且还大大节约了检测成本，特别适用于临床的大量检测，在临床诊断上具有很好的应用前景。附图说明图1为以PCV3的DNA为模板进行引物浓度优化实验的电泳检测结果；其中，M为DL2000marker（条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp），泳道1-4对应的引物加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，其特征在于，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，其中，所述用于检测猪圆环病毒3型的引物的核苷酸序列为：上游引物L1：5ˊ‑ TAGTATTACCCGGCACCTCGGA ‑3ˊ（SEQ ID NO.1），下游引物L2：5ˊ‑ GAACCCTCAGAGGGTACCTGT ‑3ˊ（SEQ ID NO.2）；所述用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物的核苷酸序列为：上游引物L3：5ˊ‑ ATGCGGCCCTTTCTGCTG ‑3ˊ（SEQ ID NO.3），下游引物L4：5ˊ‑ GCAGGACGCTCAGGTGCG ‑3ˊ（SEQ ID NO.4）。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的引物组，其特征在于，所述引物组由用于检测猪圆环病毒3型的引物和用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物组成，其中，所述用于检测猪圆环病毒3型的引物的核苷酸序列为：上游引物L1：5ˊ-TAGTATTACCCGGCACCTCGGA-3ˊ（SEQIDNO.1），下游引物L2：5ˊ-GAACCCTCAGAGGGTACCTGT-3ˊ（SEQIDNO.2）；所述用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物的核苷酸序列为：上游引物L3：5ˊ-ATGCGGCCCTTTCTGCTG-3ˊ（SEQIDNO.3），下游引物L4：5ˊ-GCAGGACGCTCAGGTGCG-3ˊ（SEQIDNO.4）。2.权利要求1所述引物组在制备检测猪圆环病毒3型和/或猪伪狂犬病毒野毒株试剂中的应用。3.一种用于检测猪圆环病毒3型与猪伪狂犬病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分组成包括：DNA提取试剂、PCR扩增试剂；其中，所述PCR扩增试剂包括：PCR扩增缓冲液、dNTP、上游引物L1、下游引物L2、上游引物L3、下游引物L4、TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分组成还包括阳性对照和阴性对照，所述阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐引弟，焦文强，王治方，吴胜军，王克领，张彬，张立宪，郎利敏，许峰，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41
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