【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物体细胞核移植，具体是提高猪体细胞核移植效率的方法。
技术介绍
1、体细胞核移植(somatic cell transfer nuclear，scnt)是将终术分化的体细胞的细胞核重编程为全能性状态，并生产与供体细胞基因型完全相同后代的一种无性繁殖技术。茵其独特的技术优势，体细胞核移植技术已经被广泛应用于许多相关领域。如：利用该技术，可以快速培育出具有优良品质的动物品种；应用该技术可以将转基因动物大量繁殖，从而在降低成本的同时大幅度提高产量；通过克隆动物可以克隆一批器官，进行器官移植。因此该技术在繁育优良家畜、治疗人类遗传病以及保护珍稀、濒危野生生物等方面具有广阔的应用前景。自1997年克隆羊多莉出生以来，该技术相继在猪、牛、马、骆驼以及猴子等哺乳动物获得成功，但至今该技术的效率依然很低，如克隆猪的出生率仅为1-2％(出生数/所用卵数)，死胎率高(20-30％)，畸形率高(30-50％)等问题，显著制约了体细胞克隆动物和转基因克隆动物等相关研究工作的开展。
2、供体细胞是体细胞核移植胚胎发育的起点，其表观修饰状态会直接影响体细胞核移植胚胎的发育能力。目前认为供体细胞核不完全或者不正确重编程是体细胞核移植效率低下的主要原因。众多研究发现，不同类型供体细胞的体细胞核移植效率具有显著差异，其中高乙酰化和低甲基化水平的供体细胞具有更高的体细胞核移植效率。同时，研究发现卵母细胞成熟和体细胞核移植胚胎发育过程中，培养环境或代谢产物积聚会导致氧化应激的发生从而导致卵母细胞和体细胞核移植胚胎发育异常。
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技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供提高猪体细胞核移植效率的方法，旨在解决上述
技术介绍
中的问题。
2、本专利技术是这样实现的，提高猪体细胞核移植效率的方法，所述方法通过利用小分子化合物和中药单体组合按时序处理分化的供体细胞、卵母细胞和体细胞核移植胚胎，进而提高猪体细胞核移植效率。
3、作为本专利技术进一步的方案：所述小分子化合物和中药单体组合包括以下组分pdk激活剂、芒果苷、shp-141、gsk3685032以及丹参酮iia。
4、作为本专利技术进一步的方案：所述小分子化合物和中药单体组合按时序分阶段使用包括：第一阶段化合物(供体细胞培养阶段)、第二阶段中药单体(卵母细胞成熟阶段)、第三阶段化合物(重构胚培养72h内)以及第四阶段中药单体(72h后-囊胚阶段)；
5、第一阶段：使用含有pdk激活剂的细胞培养基培养供体细胞；所述培养基以dmem为基础，并添加0-100μm pdk激活剂(ps48)、10％fbs以及1％青链霉素。
6、第二阶段：使用含有芒果苷的猪卵母细胞体外成熟培养液培养猪卵母细胞；所述培养液以tcm-199为基础，并添加25-100μm芒果苷、10％猪卵泡液、10iu/ml ecg、10iu/mlhcg、0.91mmol/l丙酮酸钠、10ng/ml egf以及1％青链霉素。
7、第三阶段：使用含有shp-141和gsk3685032的体外培养液培养猪体细胞核移植胚胎，形成重构胚；所述培养液以pzm-3为基础，并添加0-100nm shp-141以及0-100nmgsk3685032。
8、第四阶段：使用含有丹参酮iia的体外培养液培养猪体细胞核移植胚胎，形成囊胚；所述培养液以pzm-3为基础，并添加0-100μm丹参酮iia。
9、作为本专利技术进一步的方案：所述小分子化合物和中药单体必须按一定的时序与相应的供体细胞、卵母细胞或体细胞核移植胚胎接触。
10、本专利技术提供的小分子化合物和中药单体组合，通过调整其组分、浓度和作用时序用于提高其他体细胞核移植动物效率，也属于小分子化合物和中药单体组合的应用范围。
11、本专利技术的机理如下：本专利技术提供了能够提高猪体细胞核移植效率的小分子化合物和中药单体组合，更进一步地提供按时序分阶段使用的小分子化合物组合和中药单体，所述小分子化合物处理使供体细胞处于高乙酰化和低甲基化水平，从而提高供体细胞重编程的准确性和效率；所述中药单体进行处理以建立并维持卵母细胞及胚胎发育所需的低氧环境来拮抗氧化应激的不良作用；通过利用小分子化合物和中药单体组合接力组合提高猪体细胞核移植胚胎的体内外发育效率。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
13、通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理供体细胞，可提高重编程的准确性和可靠性，同时易于精准质控，实现标准化操作；
14、利用中药单体组合按时序分阶段处理猪卵母细胞和体细胞核移植胚胎，可有效降低外界环境带来的应激损伤，解决了卵母细胞和体细胞核移植胚胎培养周期长以及不利于大规模生产的问题；与人工合成的抗氧化物质相比，中药单体组合物具有更高的生物学活性和结构多样性，更易进入卵母细胞和体细胞核移植胚胎发挥药效，拥有更高的生物学活性，具有产业化前景。
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1.提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述方法通过利用小分子化合物和中药单体组合按时序处理分化的供体细胞、卵母细胞和体细胞核移植胚胎，进而提高猪体细胞核移植效率。
2.根据权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述小分子化合物和中药单体组合包括PDK激活剂、芒果苷、SHP-141、GSK3685032以及丹参酮IIA。
3.根据权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述小分子化合物和中药单体组合按时序分阶段使用包括：
4.根据权利要求3所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，在第一阶段中，所述培养基以DMEM为基础，并添加0-100μM PDK激活剂、10％FBS以及1％青链霉素。
5.根据权利要求3所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，在第二阶段中，所述培养液以TCM-199为基础，并添加25-100μM芒果苷、10％猪卵泡液、10IU/mL eCG、10IU/mL hCG、0.91mmol/L丙酮酸钠、10ng/mL EGF以及1％青链霉素。
6.根据
7.根据权利要求3所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，在第四阶段中，所述培养液以PZM-3为基础，并添加0-100μM丹参酮IIA。
8.根据权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述小分子化合物和中药单体按预定的时序与相应的供体细胞、卵母细胞或体细胞核移植胚胎接触。
...【技术特征摘要】
1.提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述方法通过利用小分子化合物和中药单体组合按时序处理分化的供体细胞、卵母细胞和体细胞核移植胚胎，进而提高猪体细胞核移植效率。
2.根据权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述小分子化合物和中药单体组合包括pdk激活剂、芒果苷、shp-141、gsk3685032以及丹参酮iia。
3.根据权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，所述小分子化合物和中药单体组合按时序分阶段使用包括：
4.根据权利要求3所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，在第一阶段中，所述培养基以dmem为基础，并添加0-100μm pdk激活剂、10％fbs以及1％青链霉素。
5.根据权利要求3所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：张家庆，王献伟，吕玲燕，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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