【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种响应维生素b12（adenosylcobalamin）的生物元件及其应用，属于基因工程、分子检测和生物传感。
技术介绍
1、维生素b12又名钴胺素，是咕啉类化合物，在药物和食品工业中具有广泛应用。维生素b12分子量较大，化学结构复杂，化学法人工合成耗时耗力，成本高且合成周期长，并且在合成过程中对操作人员的要求很高，导致其不适用于工业化生产。自然界中的一些微生物可以自身合成维生素b12来满足生长需要，是维生素b12合成的天然细胞工厂。目前微生物发酵法是生产维生素b12最廉价的方法，在工业生产中大量采用。根瘤菌作为一种维生素b12天然生产菌株，在工业生产中具有很大的潜力。
2、目前，国内外提高维生素b12微生物发酵产量最有效的策略为菌种进化工程和发酵工艺优化。菌种进化工程成功的关键是要获得尽量多的突变体文库和建立高效的筛选策略。现在普遍运用hplc、lc-ms等技术检测维生素b12产量，相对繁琐且耗时耗力，大大限制了菌株的筛选效率。因此，建立能够快速检测胞内维生素b12含量的生物传感器应用于菌种进化工程的快速高通量筛选中，能够相对快速和容易的筛选得到高产菌株，提高育种效率，对于促进维生素b12微生物发酵产业增长具有重要应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是发掘维生素b12响应元件，构建一种维生素b12生物传感器，以满足对维生素b12快速检测的需求。
2、本专利技术第一个目的是提供一个响应维生素b12(adenosylcob
3、本专利技术的第二个目的是提供一种生物传感器，含有维生素b12核糖开关 rs1888和编码标记物基因； rs1888通过响应维生素b12浓度的变化调控编码标记物基因的表达。
4、在本专利技术的一种实施方式中，维生素b12核糖开关 rs1888和编码标记物基因位于质粒载体上，即所述生物传感器是质粒。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒载体为pme6032。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述标记物为绿色荧光蛋白gfp。具体地，编码所述gfp的基因的核苷酸序列如seq id no. 6所示。
7、进一步地，通过引入转录抑制因子与其调控的启动子改变传感器的响应特性和灵敏度与增强响应信号强度，通过引入 laci与 laco降低传感器的本底泄露表达。由此得到的优化的生物传感器，其进一步含有表达 laci编码基因与 laco编码基因的核苷酸序列，且将 laco编码基因置于 ptetr启动子后， laci编码基因表达的laci蛋白通过与 laco结合会抑制 ptetr启动子的转录，从而降低传感器的本底泄露表达。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述转录抑制因子与其调控启动子为tetr和 ptetr，编码所述tetr的基因的核苷酸序列如seq id no. 2所示，编码所述 ptetr的核苷酸序列如seq id no. 4所示。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述laci的编码基因的核苷酸序列如seq id no. 3所示，所述 laco的编码基因的核苷酸序列如seq id no. 5所示。
10、本专利技术的第三个目的是提供一种筛选高产维生素b12菌株的方法，将上述维生素b12生物传感器转化入苜蓿中华根瘤菌，实现维生素b12产量和荧光强度的关联，利用荧光强度筛选高产菌株。
11、本专利技术还要求保护所述生物传感器在菌株筛选以及维生素b12合成途径酶活和表达量优化等方面的应用。
12、本专利技术的有益效果：本专利技术提供的维生素b12生物传感器可以实现维生素b12浓度和荧光强度在一定范围内的良好关系，达到快速检测维生素b12的目的，可以用于快速筛选高产维生素b12菌株，具有很好地应用前景。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种响应维生素B12的核糖开关元件，其特征在于：能够结合维生素B12并下调下游基因转录；所述核糖开关元件的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示或其来源于苜蓿中华根瘤菌的同源序列。
2.一种生物传感器，其特征在于，含有如权利要求1所述的维生素B12核糖开关元件与标记物基因；优选地，所述生物传感器是质粒，更具体地，所述质粒载体为pME6032。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于：所述标记物基因为荧光蛋白编码基因。
4.一种如权利要求2述的生物传感器，其特征在于：还含有转录抑制因子与其调控启动子，并且所述核糖开关元件调控所述转录抑制因子的表达，而转录抑制因子控制编码标记物基因的表达。
5.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于：所述转录抑制因子为TetR，其调控启动子为PtetR。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其特征在于：编码所述TetR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，编码所述PtetR的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
7.根据权利要求2～6任一项所述
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于：所述lacI编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述lacO编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
9.一种筛选产维生素B12菌株的方法，其特征在于：将权利要求2～8任一项所述的生物传感器转入待筛选的具有维生素B12生产能力的菌株中，检测标记物基因表达强度来筛选产维生素B12菌株；优选地，所述菌株是苜蓿中华根瘤菌。
10.利用权利要求2～8任一所述的生物传感器通过检测维生素B12合成量来优化维生素B12合成途径相关蛋白的表达或酶活方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种响应维生素b12的核糖开关元件，其特征在于：能够结合维生素b12并下调下游基因转录；所述核糖开关元件的核苷酸序列如seq id no. 1所示或其来源于苜蓿中华根瘤菌的同源序列。
2.一种生物传感器，其特征在于，含有如权利要求1所述的维生素b12核糖开关元件与标记物基因；优选地，所述生物传感器是质粒，更具体地，所述质粒载体为pme6032。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于：所述标记物基因为荧光蛋白编码基因。
4.一种如权利要求2述的生物传感器，其特征在于：还含有转录抑制因子与其调控启动子，并且所述核糖开关元件调控所述转录抑制因子的表达，而转录抑制因子控制编码标记物基因的表达。
5.根据权利要求4所述的生物传感器，其特征在于：所述转录抑制因子为tetr，其调控启动子为ptetr。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其特征在于：编码所述tetr的基因的核苷酸序列如seq id no. 2所示，编码所述pte...
【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，王会颖，董会娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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