【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方法及其应用。
技术介绍
1、副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis)为猪上呼吸道的常在菌，是引起猪格拉泽氏病的病原，其在某些应激环境条件下侵入仔猪体内，导致宿主出现如胸膜炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎为病症的传染病菌。
2、随着自然环境不断变化，许多革兰阴性菌演变出既可摄取足够营养成分，又能灵敏感知并适应外界环境的变化的膜应激系统。cpx双组份系统是细菌重要的膜应激系统之一，能被各种应激条件诱导，反过来调控细菌的各种表型。
3、cpx系统包括cpxa传感器组氨酸激酶和cpxr响应调节器。当cpxa受到不同环境信号(如ph变化、低铁条件)的刺激后被激活，磷酸基从cpxa转移到cpxr，然后磷酸化的cpxr与dna结合，启动基因表达调控。cpxa是组氨酸蛋白激酶，负责感受外界环境刺激并通过自磷酸化将信号传递给反应调节蛋白cpxr，磷酸化的cpxr通过调控靶基因的转录和表达影响细菌的生理活性从而应对外界刺激使得细菌适应外界环境并存活下来。外界刺激结束后cpxa通过降解磷酸化的cpxr，从而终止调控反应。cpx双组份系统通过反应调节蛋白cpxr的磷酸化水平使得细菌对外界环境特定信号的反应处于一个适度的状态。随着近些年来对cpx双组份系统和细菌耐药性的研究，发现cpx双组份系统和多种其他种类的抗生素耐药性相关。cpx双组份系统作为细菌细胞膜应激应答系统，其对耐药性的影响往往是通过细胞膜成分的改变实现的。除此之外研究发现
4、cpx系统作为细胞膜应激应答系统对许多病原菌的感染过程具有调控作用。cpx系统对多种病原菌的毒力具有调控作用，并且部分细菌是通过影响细菌分泌系统或者菌毛等毒力因子的表达从而影响细菌的感染过程，由于cpx双组份系统的作用范围十分广泛，因此对细菌毒力的影响机制就十分复杂，从最初cpx影响细菌表面结构从而影响细菌毒力到近期cpx双组份系统调控其他调控因子的表达从而影响细菌毒力，以及cpx双组份系统与其他调控系统之间的相互作用，都表明了cpx双组份系统的调控作用非常广泛且复杂。
5、随着养殖模式的转变和免疫抑制病的出现，由副猪嗜血杆菌引起的革拉泽氏病成为养猪场常见的、多发的并且危害严重的猪呼吸系统疾病之一。因临床抗生素的滥用，导致细菌的耐药性越来越强，以至治疗成本也越来越高。cpx双组份系统作为一个细胞膜应激应答的信号转导系统，对多种病原菌的生存和致病性具有重要作用。由于血清5型在临床上分离比例最高，毒力较强危害性最大，因此本专利技术构建副猪嗜血杆菌血清5型的cpxar双组分基因缺失株，为研制副猪嗜血杆菌cpxar双基因缺失的新型高效且具有交叉保护力的弱毒疫苗及该病的综合防控提供科学依据。
技术实现思路
1、针对目前副猪嗜血杆菌各地流行血清型不一，存在多种灭活疫苗缺乏具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗，而细菌耐药性增强的问题，本专利技术提供一株副猪嗜血杆菌血清5型的cpxar双组分基因缺失株，并研制出新型高效、具有交叉保护力的副猪嗜血杆菌cpxar双基因缺失弱毒疫苗。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一株双基因缺失的副猪嗜血杆菌，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis)血清5型临床分离菌株hn1570的cpxa和cpxr基因缺失的双基因缺失株hps5△cpxar，保藏编号为cgmcc no：45596，保藏日期为2023年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3、本专利技术还提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
4、步骤一、引物的设计与合成：参考genbank报道的副猪嗜血杆菌血清5型sh0165株全基因组no.cp001321序列，设计含有酶切位点及dna摄取信号序列uss的引物cpxaruf/cpxarur、cpxardf/cpxardr，用于扩增cpxar上下游同源臂；参考质粒pshk3-kan序列设计引物kanf/kanr扩增kan基因；其中所用引物序列如下：
5、cpxaruf：cggaattcaccgcttgtaagtggtatttcttagcaat
6、cpxarur：tatttttatcttgtgcaatgagctctatttccctattccat
7、cpxardf：taatcagaattggttaattgtatcaatatattgtcaatatc
8、cpxardr：cgggatccacaagcggtagccgcaaacatactttgac
9、kanf：cattgcacaagataaaaatatat
10、kanr：ttattccacccacaacggcaa；
11、步骤二、基因的克隆与重组自杀性质粒的构建：以副猪嗜血杆菌血清5型临床分离株hn1570株基因组为模板，分别用引物对cpxaruf/cpxarur和cpxardf/cpxardr扩增出cpxar基因上游和下游片段；用引物kanf/kanr从pshk3质粒中扩增卡那霉素基因；利用重叠延伸pcr扩增原理用引物cpxaruf/cpxardr将cpxar基因上游片段、下游片段和卡那霉素基因通过重叠延伸pcr连接，形成重叠片段ukd；用bamhⅰ和ecorⅰ酶切ukd片段，连接到pk18mobsacb，构建得到自杀性质粒pkukd；
12、步骤三、双基因缺失株的构建：参考自然转化法，大量提取重组质粒pkukd并测定浓度；挑取转化子，提取基因组，分别用引物cpxaruuf/cpxarddr、cpxarf/cpxarr、kanf/kanr扩增ukd序列、cpxar基因和kan基因，电泳检测目的片段的大小及有无来鉴定是否成功构建cpxar缺失株，并测序验证。
13、上述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，步骤二中以副猪嗜血杆菌hn1570株基因组为模板，用引物对cpxaruf/cpxarur和cpxardf/cpxardr扩增出cpxar基因上游683bp和下游658bp的片段；用引物kanf/kanr从pshk3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。
14、上述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，步骤三中自然转化法提取重组质粒pkukd，具体步骤为：挑取hn1570单菌落于5ml tsb中，37℃培养至od600值为0.8，取20μl菌液加入8mmol/l camp20μl，混匀，反应10min，加入2μg重组质粒pkukd，混匀，反应10min后加入到tsa上，涂布均匀，37℃孵育5h。tsb洗下细菌，转移到含kan的tsa固体培养基上中，37℃培养24～48h。
15、本专利技术还提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗方面的应用。...
【技术保护点】
1.一株双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）血清5型临床分离菌株HN1570的cpxA和 cpxR基因缺失的双基因缺失株HPS5△cpxAR，保藏编号为CGMCC NO：45596，保藏日期为2023年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤二中以副猪嗜血杆菌HN1570株基因组为模板，用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游683bp和下游658bp的片段；用引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。
4.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤三中自然转化法提取重组质粒pKUKD，具体步骤为：挑取HN1570单菌落于5mL
5.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗中副猪嗜血杆菌HPS5△cpxAR的含量为1×1010 CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：将所述副猪嗜血杆菌依次经过增殖、浓缩后得到的副猪嗜血杆菌抗原液，向抗原液中加入免疫佐剂即得疫苗。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂Summit S550。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：
...【技术特征摘要】
1.一株双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）血清5型临床分离菌株hn1570的cpxa和 cpxr基因缺失的双基因缺失株hps5△cpxar，保藏编号为cgmcc no：45596，保藏日期为2023年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤二中以副猪嗜血杆菌hn1570株基因组为模板，用引物对cpxaruf/cpxarur和cpxardf/cpxardr扩增出cpxar基因上游683bp和下游658bp的片段；用引物kanf/kanr从pshk3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。
4.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤三中自然转化法提取重组质粒pkukd，具体步骤为：...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐引弟，王治方，朱文豪，雷亚楠，张立宪，许峰，焦文强，李海利，郎利敏，游一，王克领，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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