基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针及其试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针及其试剂盒与方法。引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe；检测试剂盒包括引物组、2×RT‑ddPCR Supermix、无RNA酶的蒸馏水、病毒总RNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品RNA，利用微滴数字PCR技术对待检样品RNA进行定量检测，通过扩增分析得到的拷贝数判断待检样品是否含有猪繁殖与呼吸综合症欧洲型病毒，并测定其含量。本发明专利技术具有精准、灵敏、适用性广，无需依赖标准曲线，可实现绝对定量等优点，可实现猪繁殖与呼吸综合症诊断的早发现、早预防，能有效控制疫情爆发。目前尚未有将数字PCR技术应用于定量检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针及其试剂盒与方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针及其试剂盒与方法。
技术介绍
猪呼吸繁殖综合症(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV))引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，临床症状为妊娠母猪早产、流产、产死胎和木乃伊胎以及仔猪出现呼吸困难等。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，基因组为单链正股RNA，大小约15kb，包含10个开放阅读框，5`端非编码区和3`端非编码区。根据PRRSV的基因型差异，可分为美洲型与欧洲型，其中美洲型PRRSV的鉴定检测方法报道较多，但针对欧洲型PRRSV的检测报道较少。目前检测PRRSV的方法主要包括传统的病毒分离和鉴定、免疫组织化学和免疫荧光，这些方法都存在着技术上要求高、耗时耗力和低灵敏度等缺点，不适用于日常诊断分析。近年来，以分子生物学为基础的检测方法包括反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)、实时荧光PCR(realtimeRT-PCR)和反转录环介导等温扩增技术(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)因其灵敏度高、特异性强和方便快速而广泛应用于临床诊断。但是，RT-PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测；RT-LAMP由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。数字PCR(digitalPCR，dPCR)是近十年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过PCR扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。与实时荧光PCR相比，该方法具有精准、灵敏度超高和不易受PCR抑制物影响等优点。而现有技术并没有利用数字PCR技术针对PRRSV欧洲型病毒进行绝对定量检测的相关研究以及是否可行的相关方案及适合产业化的成品试剂盒。因此，开发相关利用数字PCR技术对PRRSV欧洲型病毒进行绝对定量检测方法和试剂是业界亟待解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒。本专利技术所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一方面，本专利技术提供了一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：FP：5-AAAGCCTGAGAAGCCACATTTT-3(SEQIDNO：1)；BP：5-GGTGGTGCCGGATGTCAT-3(SEQIDNO：2)；Probe：5-FAM-CCCTGGCTGCTGAA-BHQ1-3(SEQIDNO：3)，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是BHQ1。优选地，扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为3：3：2。另一方面，本专利技术还公开了一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物和探针。优选地，基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×RT-ddPCRSupermix；(2)无RNA酶的蒸馏水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)病毒总RNA提取试剂。优选地，所述的2×RT-ddPCRSupermix含有：2×One-stepRT-ddPCRSupermix和25mMManganousacetate。优选地，阳性对照为PRRSV欧洲型病毒细胞培养物，阴性对照为去离子水。优选地，病毒总RNA提取试剂包括裂解液A、洗液B、洗液C、洗脱液D、吸附柱和收集管。再有，本专利技术还公开了一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的方法，包括如下步骤：(1)病毒RNA的提取1)取待检样品和阳性对照，分别加入600μL裂解液A，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；3)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；4)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；6)将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μL，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板RNA；(2)RT-ddPCR操作1)设待检样品、阴性对照和阳性对照总和为N，反应体系配置RT-ddPCR反应体系，将以上配置的反应体系充分混匀后，分装至每个反应管各19μL；2)分别取1μL模板RNA，加入相应的反应管中，终体积为20μL，所述模板RNA包括待检样品、阴性对照和阳性对照；3)将20μL样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；4)将微滴转入PCR板中，放入PCR仪中进行扩增；5)将扩增完成的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；6)结果判定及描述：阳性对照：30±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。优选地，RT-ddPCR反应体系为20μL反应体系，其含有10μmol/LFP和BP引物各0.6μL，10μmol/L探针0.4μL，2×RT-ddPCRSupermix10μL，用去离子水补齐到19μL，加入1μL模板后为20μL。优选地，扩增程序为：60℃反应30min；95℃反应5min；94℃反应30sec，60℃反应60sec，40个循环；98℃反应10min；每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。本专利技术以微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)技术为依托，开发基于数字PCR技术绝对定量检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒及检测方法。目前尚未有将微滴数字PCR技术应用于检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现PRRSV欧洲型病毒的快速、精准定量，为猪繁殖与呼吸综合症的早期诊断提供有力的技术支持，有着广阔的应用前景和产业化前景。因此，相比于现有的其他检测技术，本专利技术技术具有精准、灵敏、适用性广等优点：(1)结果精准：实现绝对定量，不依赖Ct值，无需标准曲线，更精准的检测病毒含量，为猪病诊断提供准确的诊断依据；(2)灵敏度高：可检测单拷贝模板；(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：FP：5‑AAAGCCTGAGAAGCCACATTTT‑3；BP：5‑GGTGGTGCCGGATGTCAT‑3；Probe：5‑FAM‑CCCTGGCTGCTGAA‑BHQ1‑3，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是BHQ1。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：FP：5-AAAGCCTGAGAAGCCACATTTT-3；BP：5-GGTGGTGCCGGATGTCAT-3；Probe：5-FAM-CCCTGGCTGCTGAA-BHQ1-3，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是BHQ1。2.如权利要求1所述的基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的引物和探针，其特征在于：扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为3：3：2。3.一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物和探针。4.如权利要求3所述的基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×RT-ddPCRSupermix；(2)无RNA酶的蒸馏水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)病毒总RNA提取试剂。5.如权利要求4所述的基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒，其特征在于：所述的2×RT-ddPCRSupermix含有：2×One-stepRT-ddPCRSupermix和25mMManganousacetate。6.如权利要求4所述的基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的试剂盒，其特征在于：阳性对照为PRRSV欧洲型病毒细胞培养物，阴性对照为去离子水。7.一种基于数字PCR技术检测PRRSV欧洲型病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)病毒RNA的提取1)取待检样品和阳性对照，分别加入600μL裂解液A，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；3)丢弃收集管中液体，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，曹炜伟，陈洵，常彦磊，李丽丽，石磊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44