本发明专利技术提供一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测方法，所使用的引物对和探针组，引物和探针具有序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的碱基序列。本发明专利技术提供一种基于分子生物学的快速检测禽传染性支气管炎病毒的方法，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。
【技术实现步骤摘要】
一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括鉴定禽传染性支气管炎病毒的引物对探针。
技术介绍
鸡传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)可引起鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，即鸡传染性支气管炎。该病以咳嗽、气管啰音和打喷嚏为主要特征，是对我国养鸡业危害最为严重的病毒性传染病之一，该病几乎在世界范围内所有的养鸡国家存在，在我国的流行呈上升趋势。IBV血清型众多，目前已报道30余种，不同血清型毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，相互间没有或仅有部分交叉免疫性，尤其是近些年，新的血清型不断出现，急需能够检测所有血清型的高通量检测方法用于临床诊断。传统检测方法已不适于现代疫病监测和诊断的需要，急需制定能够高通量检测、结果易于判定的荧光RT-PCR检测技术标准，用于我国鸡传染性支气管炎的诊断和防控。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan法)，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一组特异性引物对和探针组，引物和探针具有序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:3的碱基序列，具体序列信息如下：正向引物IBV-F：5′-TTGAAGGTAGYGGYGTTCCTGA-3′(SEQIDNO:1)反向引物IBV-R：5′-CAGMAACCCACACTATACCATC-3′(SEQIDNO:1)探针IBV-Probe：5′-ACWGGAACAGGACCDGCCGCTGACCT-3′(SEQIDNO:1)；其中探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。所提供的引物和探针在制备用于检测禽传染性支气管炎病毒的制品中的应用；本专利技术再一个方面提供检测临床样品中禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：1)配置荧光定量RT-PCR反应体系反应液每管25μL，含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL，5U/μLTaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μL，10pmol/μL正向引物IBV-F、反向向引物IBV-R和探针IBV-Probe各0.5μL，RNaseFreedH2O8μL，待检测的样品RNA模板2μL；2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环。保存文件，运行；3)结果判定结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。本专利技术提供一种基于分子生物学的快速检测禽传染性支气管炎病毒的方法，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBRGreen染色法造成的污染和低特异性。附图说明图1：禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物位置由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；图2：本专利技术引物和探针的灵敏度检测结果图；图3：本专利技术引物和探针的特异性检测结果图。具体实施方式实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：引物及探针设计与筛选：根据禽传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因(N基因)进行引物设计，通过NCBI查找到公开的306株包含各基因型禽传染性支气管炎病毒的N基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于151-480位的基因(参考序列GenBank登录号：KJ425486)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，上游引物所在区域对应的参考序列第212位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是A和G两种，因此引物序列中设计成简并碱基R，第218位和221位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是T和C两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y；下游引物所在区域对应的参考序列第401位和405位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是T和G两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应A和C，因此引物序列中设计成简并碱基M。上游引物IBV-F1：5′-TTGAAGGTAGYGGYGTTCCTGA-3′(26bp)上游引物IBV-F2：5′-TTGARGGTAGYGGYGTTCCTGA-3′(23bp)下游引物IBV-R1：5′-CAGMAACCCACACTATACCATC-3′(24bp)下游引物IBV-R2：5′-CAGMAACMCACACTATACCATC-3′(25bp)以引物组对应目的条带区间为模板设计2条探针，进行最佳探针筛选，探针序列所在区域对应的参考序列第356位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基有A、T和G三种，因此探针序列中设计成简并碱基D；对应的参考序列第363位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是A和G两种，因此探针序列中设计成简并碱基R。探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。修饰后探针序列如下：IBV-P1：5′-HEX-GAACAGGACCDGCCGCTRACC-BHQ1-3′(29bp)IBV-P2：5′-HEX-ACTGGAACAGGACCDGCCGCTGACCT-BHQ1-3′(24bp)2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。组合1：IBV-F1、IBV-R1和IBV-P1组合2：IBV-F1、IBV-R2和IBV-P1组合3：IBV-F2、IBV-R1和IBV-P1组合4：IBV-F2、IBV-R2和IBV-P1组合5：IBV-F1、IBV-R1和IBV-P2组合6：IBV-F1、IBV-R2和IBV-P2组合7：IBV-F2、IBV-R1和IBV-P2组合8：IBV-F2、IBV-R2和IBV-P2引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物对和探针组，其特征在于，所述引物对和探针的序列信息如下：正向引物IBV‑F：5′‑TTGAAGGTAGYGGYGTTCCTGA‑3′、反向引物IBV‑R：5′‑CAGMAACCCACACTATACCATC‑3′、探针IBV‑Probe：5′‑ACWGGAACAGGACCDGCCGCTGACCT‑3′。
【技术特征摘要】
1.一种引物对和探针组，其特征在于，所述引物对和探针的序列信息如下：正向引物IBV-F：5′-TTGAAGGTAGYGGYGTTCCTGA-3′、反向引物IBV-R：5′-CAGMAACCCACACTATACCATC-3′、探针IBV-Probe：5′-ACWGGAACAGGACCDGCCGCTGACCT-3′。2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测禽传染性支气管炎病毒的制品中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量检测试剂盒。5.一种用于检测禽传染性支气管炎病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒使用了权利要求1或2所述的引物对和探针组。6.一种检测临床样品中禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)配置荧光定量RT-PCR反应体系反应液每管25μL，含有2×OneStepR...
【专利技术属性】
技术研发人员：王楷宬，王素春，黄保续，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。