阿尔茨海默病动物模型的制备方法技术

阿尔茨海默病动物模型的制备方法，制备步骤为：设计以动物脑abcg4为靶基因的siRNA，(经试验)其特异的能干涉abcg4表达的siRNA的靶序列为：GTGAGAAGCAAGAGGTGAA，用PBS溶解；选健康动物，用脑定位仪以240μg/kg体重的剂量向动物侧脑室内一次性注射siRNA，48h后得到动物模型。本发明专利技术方法制备动物模型时间短，对试验动物损伤不大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及阿尔茨海默病动物模型建立
，具体涉及用于分析阿尔茨海默病病理及阿尔茨海默病药物筛选的动物模型的制备方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，表现为进行性的记忆和认知功能的下降，行为异常和社交障碍。随着社会人口的老龄化，AD的发病率呈不断上升趋势，已成为危及老年人生命的第四大病因(仅次于心脏病、肿瘤和中风)，成为当前老年医学所面临的最为严峻的问题之一。有资料显示，预计到2050 年，我国65岁及以上老人约占总人口的35%，80岁及以上老人约为22%，而AD患者预期可达到2500万，将成为影响家庭和社会发展的一个重要制约因素。AD特征性病理学改变为脑神经细胞外出现β -淀粉样蛋白(β -amyloid，Ai3)聚集形成的老年斑，脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结，脑皮质细胞有不同程度的减少以及星形胶质细胞的增生及肥大，并且脑内有大量的Αβ的沉积。Αβ是由一个比较大的前体蛋白即淀粉样蛋白前体(amyloid β -precursor protein, APP)水解得到的，目前认为，Αβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素。AD病因有遗传因素、免疫功能改变、炎症作用、铝中毒、雌激素水平、细胞骨架改变和神经递质改变等内在原因，外部因素包括年龄因素、血管性因素、胆固醇、病毒感染、职业、教育水平、吸烟、头部外伤、用脑减少等，其中有些外部因素作为AD患者的危险因素，争议较多有待于进一步研究。总之，AD的发病机制十分复杂，可能与多种因素有关，概括地说是内在原因和外在因素相互作用的结果。目前还没有针对AD治疗的特效药。AD研究进展缓慢的一个主要原因在于没有一个合适的动物模型来再现各种病理特征及评价各种治疗方法的有效性。目前建立AD模型的方法很多，但由于AD的发病机制和病变过程复杂，但尚无能够全力再现、模拟AD病理、生化、行为等方面全部特征的动物模型。所以，良好的AD动物模型的出现，将会对AD的研究和药物开发有着跨时代的意义。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种构建，该方法模拟人类阿尔茨海默病的发病过程，所制备的动物模型出现脑内APP表达上升，Αβ生成增多的典型症状，能适合于阿尔茨海默病病理研究和进行药物筛选。技术方案，制备步骤为设计以动物脑abcg4 为靶基因的siRNA，其特异的siRNA的靶序列为GTGAGAAGCAAGAGGTGAA，用PBS溶解；选健康动物，用脑定位仪以240 μ g/kg体重的剂量(指每公斤体重siRNA的有效剂量)向动物侧脑室内一次性注射siRNA，4 后得到动物模型。所述PBS 配方为 NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO431. 4mmol/L ρΗ7· 2 7· 4。本专利技术方法的特点为SiRNA干涉脑中abcg4基因的表达，进而引发脑中APP表达增强，Αβ生成增多，从而制备得到阿尔茨海默病动物模型。本专利技术公开的建立阿尔茨海默病动物模型的方法，具有制作方便，成本相对便宜，重复性好的优点，模型成功可靠。所得的动物模型可用于分析阿尔茨海默病发病机理及进行治疗该病药物筛选。上述方法所得到的动物模型的验证方法包括观察动物行为变化；半定量RT-PCR 测定abcg4和APP基因表达变化，免疫印迹(Western Blot)测定APP和Αβ蛋白变化。RT-PCR的试验方法为分别取模型组和正常组脑lOOmg，抽提总RNA。每个样品总 RNAl μ g进行反转录为cDNA，再以反转录所得cDNA体积的1/10为模板，用abcg4、APP基因特异引物扩增，观察abcg4基因的干涉效果及对APP基因表达的影响。试验结果表明，模型组动物行为迟缓，出现痴呆表象，RT-PCR、Western blot试验中显示APP基因表达、APP蛋白和Αβ蛋白水平明显高于正常组，从而验证了本专利技术在小鼠中成功建立了阿尔茨海默病动物模型。有益效果本专利技术方法制备动物模型时间短，对试验动物损伤不大。本专利技术采用脑定位仪，将 abcg4-siRNA准确注射到动物侧脑室内，注射量少，致死率低，增加阿尔茨海默病的出现概率。本专利技术方法从AD病理过程中的APP上游操作，所制备的动物模型具有与人类阿尔茨海默病发病相似的过程，具有典型的阿尔茨海默病症状，因而是研究阿尔茨海默病发病机理及进行药物筛选的理想模型，具有良好的应用前景。附图说明图1为特异的abcg4-siRNA注射对鼠脑abcg4基因表达的抑制及对APP表达的增强；从附图中可以看到对于注射PBS的空白对照组，以及注射siRNA的36小时、48小时组， 作为内参基因的GAPDH的表达在各组中很接近，但Abcg4作为siRNA干涉的靶基因，其表达在注射含siRNA的两个处理组中均(比对照)受到了显著抑制；而作为淀粉样蛋白前体的 APP的表达在两个处理组中比对照明显增强。该研究揭示了基因Abcg4与阿尔茨海默氏病可能存在较大的相关性，可为今后新的防治阿尔茨海默氏病的药物设计提供思路。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。所测得的昆明小鼠脑的abcg4基因的序列为ATGGCGGAGAAGGCATTGGAGGCCGTGGGC TGTGGACTGGGCCCTGGGGCTGTGGCCATGGCTGTGACACTGGAGGACGGGGCAGAGCCCCCTGTGCTGACCACGCA CCTAAAGAAGGTGGAGAACCATATCACAGAAGCACAGCGCTTCTCTCACCTGCCCAAGCGCTCTGCTGTGGACATCG AGTTCGTGGAACTGTCCTATTCCGTGCGGGAGGGGCCCTGCTGGCGCAAACGGGGTTACAAGACCCTCCTCAAGTGC CTGTCTGGTAAGTTCTGTCGCCGAGAGCTGATTGGCATCATGGGCCCCTCTGGGGCTGGCAAGTCCACATTCATGAA CATCTTGGCAGGGTACAGGGAGTCGGGGATGAAGGGGCAGATCCTGGTTAACGGGAGGCCGCGCGAGCTGAGGACCTTCCGCAAGATGTCCTGCTACATCATGCAGGATGACATGCTACTGCCTCACCTCACAGTCCTGGAGGCCATGATGGTC TCTGCCAACCTGAAGCTGAGTGAGAAGCAAGAGGTGAAGAAGGAACTGGTGACAGAGATCCTGACAGCCCTGGGACT GATGTCCTGCTCTCACACGAGGACAGCTCTGCTCTCTGGAGGGCAGAGGAAGCGCCTGGCCATTGCTCTGGAACTGG TCAACAACCCGCCTGTCATGTTCTTTGATGAGCCTACCAGCGGTCTAGACAGCGCTTCTTGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．阿尔茨海默病动物模型的制备方法，其特征在于制备步骤为：ａ．设计以动物脑ａｂｃｇ４为靶基因的ｓｉＲＮＡ，其靶序列为：ＧＴＧＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡ，用ＰＢ　Ｓ溶解；ｂ．选健康动物，用脑定位仪以２４０μｇ／ｋｇ体重的剂量向动物侧脑室内一次性注射ｓｉＲＮＡ，４８ｈ后得到动物模型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金美，王雪芳，栗凤鹏，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：32