本发明专利技术公开了一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的培养方法。完全培养基是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液中加入3％-10％的人自体脐带血血清配制而成；培养方法包括：(1)分离；(2)原代培养；(3)传代培养。本发明专利技术采用前述完全培养基用于hAMSCs培养的优点为：回避了使用胎牛血清的风险，且无需添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和丙酮酸等，仍可保持hAMSCs较好的增殖特性和表型特征及一些干细胞多向分化潜能标志基因和蛋白表达；传代培养中hAMSCs贴壁的牢固程度明显低于FBS培养条件，消化时间明显缩短，减少了胰酶消化对细胞的损伤和细胞数量的损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)的培养方法，属于细胞工程及生物医药
技术介绍
人羊膜为附着在胎盘绒毛膜表面的一层半透明薄膜，属于胎膜组织的一部分，由胚胎发育期的细胞滋养层演化而来。除人羊膜上皮细胞以外，hAMSCs是构成人羊膜组织的主要细胞类型之一，表达胚胎干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的标志，具有多谱系分化潜能，是一种具有代表性的MSCs。在体外特定诱导条件下，hAMSCs 可分化成来自三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌样细胞、胰腺细胞和肝细胞等。 hAMSCs因其多向分化潜能和低免疫原性，体外扩增能力明显强于骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，加之其来源丰富，易于富集，不牵涉医学伦理问题等优势，且目前临床已用于角膜损伤、眼皮肤损伤和肌腱损伤等治疗，并取得较好的治疗效果。因而，hAMSCs在体细胞治疗和组织工程研究中显示出良好的应用前景。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)含有丰富的生长因子、营养成分及维持细胞生长的激素，还可为细胞贴壁、铺展提供所需的因子。因此，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如FBS)的培养基，BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养也多采用FBS。目前， hAMSCs的培养体系通常为LG-DMEM培养基中加入10%的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1 %非必需氨基酸55ymol/L 2-巯基乙醇和lmmol/L丙酮酸钠，传代培养2-4代，hAMSCs的表面标志与BMSCs相似，除表达典型的间充质细胞标志，如波形蛋白(vimentin，VIM)、CD105+、 CD90+、CD73+、CD44+、CD29+、HLA-A，B，C+、CD13+、CD10+、CD49c+、CD49d、CD49e+、CD54+ 和 CD166+、 ⑶271低表达，⑶⑶34\⑶45\⑶3Γ、⑶133-和⑶；Γ，不表达HLA-DR，还表达干细胞标志 Oct-4、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4 和其他 CD 分子 CD349、CD 140b 和 CD324 (E-cadherin) 等。但FBS等动物血清的应用，在干细胞移植后，输入异种蛋白对患者存在潜在的威胁，可产生抗FBS抗体及其他尚未知晓的不良反应，而且可能造成人与其他物种间病毒感染的传播。如何优化培养体系，找到一种既能促进MSCs增殖，又能提供多向分化潜能的优质干细胞，也是满足细胞治疗临床需求的基本条件，研究人员不断探索，努力提高细胞培养血清质量，或探索无血清培养体系等，因而，良好的培养体系的建立是生物技术产业中干细胞体外扩增应用于临床的关键、核心技术。人脐带血血清(human cord blood serum, hCBS)来源于分娩后的脐带，含有一系列营养因子和细胞因子，来源丰富、易于获取、采集方便，对供者没有损害，无生理和伦理问题，较FBS等动物血清而言，引起动物性疾病在人的传播风险小，可以避免细胞吞噬FBS中的蛋白质及移植时宿主产生免疫反应。hCBS已用于BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养， 且hCBS在BMSCs的培养扩增中明显优于优等FBS。在hCBS为主体的培养体系中，脐带间充质干细胞可稳定生长，贴壁细胞呈现典型的MSCs特征，细胞呈成纤维细胞样，平行排列生长或旋涡状生长，并可传代扩增。但有关自体hCBS用于hAMSCs培养的研究国内外尚未见报道。基于hAMSCs的良好临床应用前景，专利技术人在已建立的胰酶和II型胶原酶消化、分离、纯化和10% FBS LG-DMEM完全培养基培养hAMSCs方法基础上，首次建立自体hCBS培养体系，并观察、分析hCBS培养的hAMSCs的免疫表型、细胞增殖和细胞周期及其多能干细胞标志等，为hAMSCs用于人体细胞治疗提供基本培养技术，可望优先满足自体hAMSCs移植的需要和解决一定规模的hAMSCs细胞产品制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种完全培养基及hAMSCs的培养方法。本专利技术以人自体脐带血血清和低糖-Dulbecco极限必须培养基组成完全培养基，用于人羊膜间充质干细胞 (hAMSCs)的培养，能使细胞保持良好形态学特征和增殖能力，并保持间充质细胞及干细胞的表型标志和蛋白特征及多向分化潜能。本专利技术是这样构成的一种完全培养基，它是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基(低糖-dulbecco，s minimum essential medium，LG_DMEM)溶液中加入3%-10% 的人自体脐带血血清(human cord blood serum, hCBS)配制而成。前述低糖-Dulbecco极限必须培养基(LG-DMEM)溶液这样制备取低糖-Dulbecco极限必须培养基(LG-DMEM) IOg (Gibco公司市售产品，IOg/袋)溶于1000ml 超纯水中，调pH值至7. 2-7. 4，过滤除菌，分装，4°C保存，即可。前述人自体脐带血血清(hCBQ这样制备无菌条件下抽取脐带血50_70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37°C培养箱池，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4°C、IOOOg离心20min，收集上清15_20ml，56°C水浴灭活30min，0. 2 μ m滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，_20°C保存、备用；同时进行培养，检菌， 无细菌生长即可。一种人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs) 的培养方法，包括以下步骤(1)分离将羊膜组织用D-Hank’S液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA-2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank' s液冲洗，加入0. 75mg/ml II型胶原酶-0. 075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清；( 原代培养离心后的沉淀用完全培养基进行原代培养；(3)传代培养待人羊膜间充质干细胞生长到80% -90%融合后， 再进行传代培养。前述步骤(1)中用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA_2Na消化液消化的过程为先于 37°C消化lOmin，弃去消化液；再于37°C、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；同样方法重复消化、过滤2次。前述步骤(1)中的旋转消化条件为37°C、200rpm，消化时间为2h，经300目不锈钢网滤过，收集细胞滤液于离心管。前述步骤( 所述原代培养过程为用含3% -10% hCBS的完全培养基悬浮细胞后计数，按lX107cells/ml的细胞密度接种，37°C、5% CO2、饱和湿度条件下培养4 后换液，继续培养5-7d，每3-4d换液一次，观察细胞生长情况。前述步骤C3)所述传代培养过程为取对数生长期内，融合率80% -90%的人羊膜间充质本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种完全培养基，其特征在于：它是按体积比向低糖－Ｄｕｌｂｅｃｃｏ极限必须培养基溶液中加入３％－１０％的人自体脐带血血清配制而成。
【技术特征摘要】
1.一种完全培养基，其特征在于它是按体积比向低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液中加入3% -10%的人自体脐带血血清配制而成。2.根据权利要求1所述的完全培养基，其特征在于所述低糖-Dulbecco极限必须培养基溶液这样制备取低糖-Dulbecco极限必须培养基IOg溶于IOOOml超纯水中，调pH值至7. 2-7. 4，过滤除菌，分装，4°C保存，即可。3.根据权利要求1所述的完全培养基，其特征在于所述人自体脐带血血清这样制备 无菌条件下抽取脐带血50-70ml，注入无菌玻璃瓶中，静置于37°C培养箱池，待血凝块完全析出后，无菌条件下，超净台中吸取析出的血清，移入新的无菌离心管内，4°C、1000g离心20min，收集上清15-20ml，56°C水浴灭活30min，0. 2 μ m滤器除菌后，血清分装于5ml小瓶，-20°C保存、备用；同时进行培养，检菌，无细菌生长即可。4.一种人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于(1)分离将羊膜组织用 D-Hank' s液冲洗干净，剪碎，分装于离心管内，用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA_2Na消化液重复消化、过滤3次，剩余的羊膜组织用D-Hank’ s液冲洗，加入0. 75mg/ml II型胶原酶-0.075mg/ml Dnase I消化液旋转消化，至组织完全消化，过滤，收集细胞滤液，离心，弃上清；( 原代培养离心后的沉淀用完全培养基进行原代培养；(3)传代培养待人羊膜间充质干细胞生长到80% -90%融合后，再进行传代培养。5.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于步骤(1)中用0. 05%胰蛋白酶-0. 02% EDTA-2Na消化液消化的过程为先于37°C消化lOmin，弃去消化液；再于37°C、200rpm低速旋转，继续消化20min，经300目不锈钢网过滤，收集组织碎片于离心管内；同样方法重复消化、过滤2次。6.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于步骤(1)中的旋转消化条件为37°C、200rpm，消化时间为2h，经300目不锈钢网滤过，收集细胞滤液于离心管。7.按照权利要求4所述的人羊膜间充质干细胞的培养方法，其特征在于步骤(2)所述原代培养过程为用含3% -10%人自体脐带血血清的完全培养基悬浮细胞后计数，按 1 X 107cells/ml的...
【专利技术属性】
技术研发人员：余丽梅，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：52
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