本文提供了从木质纤维起始材料产生乙醇的方法和组合物。多种实施方案提供了多形汉逊酵母物种的带有一个或多个修饰的酵母细胞，所述修饰包括例如失活的酸性海藻糖酶基因、过表达木酮糖激酶、和/或过表达热激蛋白104。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】耐热酵母多形汉逊酵母在高温的产乙醇的木糖发酵对相关申请的交叉参考本申请要求2007年12月13日提交的待决美国临时专利申请序列号61/007，477 的优先权。美国临时专利申请序列号61/007，477通过参考并入本申请，如同完全重新写入 本文。
技术介绍
1.专利
本文提供的实施方案涉及使用酵母从D-木糖发酵生产乙醇的方法和组合物。2.背景微生物的代谢工程通常是商业上产生可用于多种应用的大量化学品的有效手段 (例如参见Lee，S. Y.等人，Macromol. Biosci. 4 157-164 (2004))。已经吸引了许多注意的 一种化学品是乙醇。尽管乙醇具有多种用途，但它最通常用作燃料。作为燃料时，乙醇是一 种低价产品，其生产成本的大部分归因于原材料的成本。因此，将期望开发从容易获得的廉 价起始材料生产乙醇的产乙醇菌(ethanolgens)和发酵方法。这些起始材料可以是例如木 质纤维。这些木质纤维可能来自例如，食物的可再生的生物质废水、制浆操作、农业残留物 和从城市回收的纸。木质纤维素是大约30 %的D-木糖(参见Ryabova，0. B.等人“Xylose andCellobiose Fermentation to Ethanol by the Thermotolerant MethylotrophicYeast Hansenula polymorpha (耐热甲基营养酵母多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)发酵木 糖和纤维二糖为乙醇)”FEMS Yeast Res. 4 157-164 (2003))。木糖是一种“木材糖”(wood sugar), IUPAC 名称是(2S，3R，4S，5R)-噁烷-2，3，4，5-四醇。只有相对少量的野生型微生物能够发酵D-木糖。这些微生物通常不适于大 规模发酵。这种不利性可能由于以下产生，例如对微生物不熟悉、难以获得微生物、生 产率差和/或在粗加工的木质纤维上生长差或当在从生物质(biomass)获得的混合糖类上生长时令人不满意的产率。C. Abbas，“Lignocellulosics to ethanol :meetingethanol demand in the future (从木质纤维到乙醇满足未来的乙醇需求)” The Alcohol Textbook(乙醇教科书)，第 4 版.(K. A. Jacques、Τ. P. Lyons 和 D. R. Kelsall 编 $t)· Nottingham UniversityPress, Nottingham, UK, 2003, H 41-57 M 弓 Iffl C. Abbas， “Emergingbiorefineries and biotechnological applications of nonconventional yeast :nowand in the future (正在出现的非常见酵母的生物精炼和生物技术应用现在 和未来)” The Alcohol Textbook (乙醇教科书)，第 4 版.(K. A. Jacques、Τ. P. Lyons 和 D. R. Kelsall 编辑).Nottingham University Press, Nottingham, United Kingdom, 2003, 第 171-191 页。酵母被认为是用于木糖的乙醇发酵的最有希望的微生物(参见Ryabova，同上)。 它们具有比细菌大的细胞，对病毒感染耐受，并易于更耐受来自乙醇的负反馈。而且，已经 广泛研究了大量物种的酵母生长和代谢。已知大量酵母天然地发酵D-木糖。这些包括 树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)(参见 Ryabova,同上；C. Abbas 2003)。已知常见啤酒酵母酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)天然地不发酵D-木糖，但已报道发酵D-木糖的生物改 造的大量酿酒酵母菌株。如附图说明图1所示，酵母中的D-木糖代谢已被报道为沿着类似于葡萄糖的经由磷酸戊糖 途径的途径进行。D-木糖的碳经糖酵解过程加工为乙醇或经由呼吸TCA循环加工为C02。已经提出，D-木糖发酵中牵涉的一个阻碍是将半纤维素的主要成分木聚糖水 解为单糖(参见Ryabova，同上)。克服这一阻碍的一种方法是通过使用“同时糖化和发 酵”(SSF)。这一工艺中，粗加工的木质纤维素被纤维素酶和半纤维素酶水解，而这一水解产 生的己糖和戊糖(包括木糖)被发酵为乙醇。这将允许持续地将糖类转化为乙醇，阻止糖 类在培养基中积聚。SSF的一种可能缺点是纤维素酶和半纤维素酶有活性的最佳温度(至少约50°C ) 与酵母生长和发酵木糖的最佳温度(约30°C) —致的差异。这一可能缺点的一种解决方 案是使用耐热甲基营养酵母多形汉逊酵母(还称为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)) 进行SSF。这种酵母已被报道为具有分别是37°C和48°C的最佳生长温度和最高生长温度。 这些温度高于大多数其它产乙醇酵母所耐受的温度(Ryabova等人)。而且，Ryabova等人 报道，在一些条件下多形汉逊酵母能够天然地发酵D-木糖(还参见Voronovsky，Α. Y.等 人“Expression of xylA Genes Encoding XyloseIsomerases From Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in theMethylotrophic Yeast Hansenula polymorpha(来 自大肠杆菌和天蓝色链霉菌的编码木糖异构酶的xylA基因在甲基营养酵母多形汉逊 酵母中的表达)”FEMS Yeast Res. 5 (11) 1055-62 (2005))。报道了多形汉逊酵母在高 温下的表现，例如在 Escalante, J.等人“Biomass Production by a Thermotolerant Yeast =Hansenula polymorpha (耐热酵母多形汉逊酵母的生物质生产)” J. Chem. Tech.Biotechnol. 48 61-70(1990) ；Tsiomenko, A. B.等 K,SecretoryHeat-Shock Protein of the Thermotolerant Yeast Hansenula polymorpha. Identification and Comparative Characteristics (耐热酵母多形汉逊酵母的分泌性热激蛋白鉴定和比较特 IE ) Biochemistry(Moscow)62(2) 123-128(1997) ；Lindquist，S. & Kim，G. ，“Heat—shock Protein 104 Expression isSuff icient for Thermotolerance in Yeast (热激蛋白 104 的表达对于酵母耐热性是足够的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离的多形汉逊酵母物种的产乙醇酵母，其中所述酵母包含选自以下组成的组的至少一种修饰：（ａ）ＡＴＨ１（酸性海藻糖酶）基因失活；（ｂ）与亲株相比过表达多形汉逊酵母的蛋白木酮糖激酶；和（ｃ）与亲株相比过表达多形汉逊酵母的蛋白热激蛋白１０４。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.12.13 US 61/007,4771.一种分离的多形汉逊酵母物种的产乙醇酵母，其中所述酵母包含选自以下组成的组 的至少一种修饰(a)ATHl (酸性海藻糖酶)基因失活；(b)与亲株相比过表达多形汉逊酵母的蛋白木酮糖激酶；和(c)与亲株相比过表达多形汉逊酵母的蛋白热激蛋白104。2.一种生产乙醇的方法，包括以下步骤a)在培养基中培养权利要求1的酵母以在所述培养基中产生和积聚乙醇；并b)从所述培养基收集乙醇。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述培养基包含D-木糖。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述产生在高于约48°C的温度发生。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述ATHl基因由于所述酵母的ATHl基因的突变、 破坏、部分缺失和/或缺失而被失活。6.根据权利要求2所述的方法，其中所述ATHl基因由于控制所述ATHl基因表达的至 少一种调控元件的突变、破坏、部分缺失和/或缺失而被失活。7.根据权利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含失活的ATHl基因。8.一种生产乙醇的方法，包括a)在含有D-木糖作为碳源的培养基中培养权利要求8的酵母，允许乙醇积聚；并b)从所述培养基收集乙醇，其中所述多形汉逊酵母产生乙醇的水平高于具有活性 ATHl基因的多形汉逊酵母产生乙醇的水平。9.根据权利要求1所述的酵母，其中在含有D-木糖作为主要碳源的培养基中所述酵母 产生乙醇的量和/或产率大于亲本多形汉逊酵母菌株产生乙醇的量和/或产率。10.根据权利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含比对照菌株更高拷贝数的多形汉 逊酵母木酮糖激酶(XYU)基因。11.根据权利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含处于非天然启动子控制下的至少 一个XYL3基因。...
【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·A·阿巴斯，安德烈·A·希博尼，安德烈·Y·沃罗诺夫斯基，奥莱纳·P·伊修克，
申请(专利权)人：阿彻丹尼尔斯米德兰德公司，
类型：发明
国别省市：US
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