针对人程序性死亡受体PD-1的抗体制造技术

本发明专利技术公开了阻断人程序性死亡受体(hPD-1)与其配体(hPD-L1或hPD-L2)及其可变区序列结合的抗体。还公开了通过PD-1途径增加免疫应答活性(或降低下调)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对人程序性死亡受体PD-1的抗体
技术介绍
程序性死亡受体1 (PD-I)是首先在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受 体。该受体与其配体的相互作用在体外和体内一直显示减弱的τ细胞应答。阻断PD-I与 其配体之一 PD-Ll间的相互作用显示提高肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫性，因此，可有助于 免疫系统清除肿瘤细胞。PD-I (由基因Pdcdl编码)为与⑶有关的免疫球蛋白超家族成员。 业已显示PD-I当与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。业 已弄清鼠PD-I结构以及小鼠PD-I与人PD-Ll的共结晶结构Chang，X.等，Immunity 20 337-347(2004) ；Lin 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 105 :3011-6 (2008)) PD-1 及类似的家 族成员为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型(V-型)结构域和负责结合信 号转导分子的胞质尾区。PD-I胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受 体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。在T细胞刺激后，PD-I将酪氨酸磷脂酶SHP-2募集到胞质尾区内的ITSM模体， 这导致效应分子的去磷酸化作用，效应分子例如有⑶3 ζ、PKC θ和ΖΑΡ70，这些分子参与 CD3T细胞信号转导级联。PD-I减量调节T细胞应答的机理与CTLA-4的相似，但又有所 不同，因为这两种分子都调控重叠的一系列信号转导蛋白(Parry等，Mol. Cell Biol. 25 9543-9553.)。Bennett及合作者表明，仅当激活和抑制两种信号都在同一表面时，PD-I介 导的对T细胞信号转导的抑制作用才会有效，这表明PD-I信号转导机制由时间及空间决定 (Bennett F.等，J Immunol. 170 :711-8 (2003)) 研究显示PD-I在激活的淋巴细胞(外周⑶4+和⑶8+T细胞、B细胞和单核细胞) 上表达，并且还显示在胸腺发育期间在⑶4TD8_(双阴性)T细胞以及NK-T细胞上表达。PD-I配体(PD-L1和PD-L2)为组成型表达，或在多种细胞类型中可被诱导，这些细 胞类型包括非造血组织以及各种肿瘤类型。PD-Ll在B细胞、T细胞、髓样细胞和树突状细 胞(DC)上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等) 中表达。与此相反，PD-L2仅在巨噬细胞和DC中存在。PD-I配体的表达模式提示了 PD-I 在维持外周耐受中的作用，并且用于调节在外周中的自我活化的T细胞和B细胞应答。两 种配体都为含有胞外区域中的IgV-样和IgC-样结构域的I型跨膜受体。两种配体都含有 含未知信号转导模体的短胞质区。迄今有大量的研究显示PD-I与其配体的相互作用在体外及体内导致抑制淋巴细 胞增殖。业已显示破坏PD-1/PD-L1相互作用可增加T细胞增殖和细胞因子产生，并阻断 细胞周期进展。最初对Pdcdl+小鼠的分析并没有鉴定任何明显的免疫学表型。然而，老 龄小鼠自发发展了与Pdcdl缺陷回交株系不同的自身免疫疾病。这些疾病包括狼疮样增殖 性关节炎(C57BL/6) (Nishimura H.等，ht. Immunol. 10 :1563-1572 (1998))、致死性心肌 病(BALB/c) (Nishimura H.等，Science 291 :319-322(2001))和 I 型糖尿病(NOD) (Wang J. ^,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102 11823-11828 (2005)) 总之，对敲除动物的分析使 得清楚了 PD-I主要起诱导并调节外周耐受的作用。因此，治疗性阻断PD-I途径可有助于克服免疫耐受。这种选择性阻断可用于治疗癌症或感染以及用于在接种(预防性或治疗性) 期间加强免疫性。在文献中已确定了 PD-I在癌症中的作用。已知肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受 有效的免疫破坏。最近显示PD-Ll在许多小鼠和人肿瘤中表达(并在大多数PD-Ll阴性肿 瘤细胞系中可由IFNy诱导)，并被推定介导免疫逃避(Iwai Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 12293-12297 (2002) ；Strome S. Ε.等，Cancer Res. ,63 :6501-6505(2003) 通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现PD-I (在 肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或PD-L1(在肿瘤细胞上)。这样的组织包括肺癌、肝癌、 卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔 鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤(Brown J. Α.等，J. Immunol. 170 1257-1266 (2003) ；Dong H.等，Nat. Med. 8 :793-800(2002) ；Wintterle 等，Cancer Res. 63 :7462-7467 (2003) ；Strome S. Ε.等，Cancer Res.，63 :6501-6505 (2003)； Thompson R. H.等，Cancer Res. 66 :3381-5 (2006) ；Thompson 等，Clin. Cancer Res. 13 1757-61 (2007) ；Nomi Τ.等，Clin. Cancer Res. 13 :2151-7. (2007)) 更引人注目的是，PD 配体在肿瘤细胞上的表达在多种肿瘤类型中与癌症患者预后不良相关联(在Okazaki和 Honjo, Int. Immunol. 19 :813-824(2007)中综述)。阻断PD-1/PD-L1的相互作用可导致肿瘤特异性T细胞的免疫性提高，因此，有助 于由免疫系统清除肿瘤细胞。针对这一问题，进行了大量研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型 中，T.Nomi 等(Clin. Cancer Res. 13 :2151-2157(2007))证明 PD-I/PD-Ll 阻断的治疗功 效。给予针对PD-I或PD-Ll的抗体显著抑制肿瘤生长。抗体阻断有效促进了肿瘤活性 CD8+T细胞浸润到肿瘤中，导致对抗肿瘤效应物(包括IFNY、粒酶B和穿孔蛋白)的增量 调节。另外，作者表明PD-I阻断可与化疗有效联合以产生协同作用。在另一项研究中，使 用小鼠鳞状细胞癌模型，对PD-I或PD-Ll的抗体阻断显著抑制肿瘤生长(Tsushima F.等， OralOncol. 42 :268-274 (2006)) 在其它研究中，当与肿瘤特异性CTL克隆共同培养时，用PD-Ll转染鼠肥大细胞瘤 细胞系导致肿瘤细胞的裂解减少。当加入抗PD-LlmAb时，细胞裂解得以恢复(Iwai Y.等， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 :12293-12297 (2002)) 研究显示在小鼠肿瘤模型中体内 阻断PD1/PD-L1的相互作用提高过继性T细胞转移疗法的功效(Strome S. Ε.等本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．结合人ＰＤ－１的分离的抗体或抗体片段，其包含：ａ．至少一个选自以下序列的ＣＤＲ：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、１０、１１、１５、１６和１７或任何所述序列的变体；和／或ｂ．至少一个选自以下序列的ＣＤＲ：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、１３、１４、１８、１９和２０或任何所述序列的变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.06.18 US 60/9445831.结合人PD-I的分离的抗体或抗体片段，其包含a.至少一个选自以下序列的⑶R:SEQ ID NO :9、10、11、15、16和17或任何所述序列的 变体；和/或b.至少一个选自以下序列的CDR:SEQ ID NO :12、13、14、18、19和20或任何所述序列的变体。2.权利要求1的抗体或抗体片段，其包含a.轻链⑶RSEQ ID NO :9、10和11或任何所述序列的变体；和重链⑶R SEQ ID NO: 12,13和14或任何所述序列的变体；或b.轻链⑶RSEQ ID N0:15、16和17或任何所述序列的变体；和重链⑶R SEQ ID NO: 18、19和20或任何所述序列的变体。3.权利要求2的抗体或抗体片段，其包含a.包含选自以下的氨基酸序列的重链可变区i.SEQ ID NO 5或其变体；ii.SEQ ID NO 7 或其变体；iii.SEQ ID NO 30的20-139位氨基酸残基或其变体；和iv.与SEQID NO 30的20-139位氨基酸残基具有至少90%同源性的氨基酸序列； 和进一步包含b.包含选自以下的氨基酸序列的轻链可变区i.SEQ ID NO 6或其变体；ii.SEQ ID NO 8 或其变体；iii.SEQ ID NO 32的20-130位氨基酸残基或其变体；iv.SEQ ID NO :33的20-130位氨基酸残基或其变体；v.SEQ ID NO 34的20-130位氨基酸残基或其变体；和vi.与SEQID NO :32、33、34的20-130位氨基酸残基具有至少90%同源性的氨基酸序列。4.权利要求1的抗体，所述抗体包含a.包含选自以下的氨基酸序列的重链i.SEQ ID NO 31的20-466位氨基酸残基或其变体；和ii.SEQ ID NO 35的20-469位氨基酸残基或其变体； 禾口b.包含选自以下的氨基酸序列的轻链i.SEQ ID NO 36的20-237位氨基酸残基或其变体；ii.SEQ ID NO 37的20-237位氨基酸残基或其变体；和iii.SEQ ID NO 38的20-237位氨基酸残基或其变体。5.上述权利要求中任一项的抗体或抗体片段，其中任何所述变体可包含至多3个保守 修饰的氨基酸取代。6.权利要求1-3中任一项的抗体，所述抗体进一步包含a.人重链恒定区或其变体，其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代；和/或b.人轻链恒定区或其变体，其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代。7.权利要求6的抗体，其中所述人重链恒定区包含Y4或Yl人重链恒定区或其变体， 其中所述变体包含至多20个保守修饰的氨基酸取代。8.上述权利要求中任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段a.以约IOOpM或更低的Kd结合人PD-I；b.以约30pM或更低的Kd结合人PD-I；c.以与以下抗体接近相同的Kd结合人PD-I所述抗体具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重链和包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的轻链；d.以与以下抗体接近相同的Kd结合人PD-I所述抗体具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重链和包含SEQ ID NO 33的氨基酸序列的轻链；e.以约7.5x1051/M · s或更快的k结合结合人PD-1 ；f.以约IxlO6VM· s或更快的k结合结合人PD-I ；g.以约2X10_51/S或更慢的k·结合人PD-I；h.以约2...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·J·卡文，H·范伊宁纳姆，G·J·杜洛斯，
申请(专利权)人：奥根农股份公司，
类型：发明
国别省市：NL