本发明专利技术公开一种复合纳米结构的电化学细胞传感器，它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成。用于进行电化学细胞传感的多功能混合纳米探针（HRP-TRAIL-Fe3O4@Au）由通过共固定化作用固定了重组人TRAIL蛋白及辣根过氧化氢气化酶（HRP）的金纳米粒子修饰的磁性Fe3O4纳米球构成；电极接口是以层层组装的方法构建的集成了具有高度生物相容性的以树状聚合物稳定的金纳米粒子（AuDSNPs）、高电阻率的氮掺杂碳纳米管（CNx）和高特异性的细胞定位寡核苷酸适配子的具有纳米层状结构的电极细胞传感界面。本发明专利技术可对白血病细胞及其表面的DR4/DR5死亡受体表达进行选择性的量化检测。本发明专利技术公开了其制法。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种复合纳米结构的电化学细胞传感器，它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成。用于进行电化学细胞传感的多功能混合纳米探针（HRP-TRAIL-Fe3O4@Au）由通过共固定化作用固定了重组人TRAIL蛋白及辣根过氧化氢气化酶（HRP）的金纳米粒子修饰的磁性Fe3O4纳米球构成；电极接口是以层层组装的方法构建的集成了具有高度生物相容性的以树状聚合物稳定的金纳米粒子（AuDSNPs）、高电阻率的氮掺杂碳纳米管（CNx）和高特异性的细胞定位寡核苷酸适配子的具有纳米层状结构的电极细胞传感界面。本专利技术可对白血病细胞及其表面的DR4/DR5死亡受体表达进行选择性的量化检测。本专利技术公开了其制法。【专利说明】—种纳米结构电化学细胞传感器制法及其制得的传感器和用途
本专利技术涉及四氧化三铁/金复合纳米结构电化学细胞传感器以及在白血病细胞及其表面死亡受体表达选择性定量分析方法。
技术介绍
白血病主要影响骨髓，血细胞和淋巴系统的其他部分，是最常见的致死性癌症之一。其具有的先天和后天的抗化疗、放疗的特性一直是治疗白血病的主要障碍之一，为克服这一障碍，一种潜在的辅助常规治疗方法是直接通过激活细胞凋亡的死亡受体介导来诱导细胞的死亡。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL )是最近发现的日益扩大的肿瘤坏死因子超级家族中的一员，其与同源的死亡受体DR4和DR5的特异性结合具有很强的亲和力。将TRAIL蛋白与白血病细胞表面的DR4/DR5相结合，能够引发独立于p53状态的各种白血病细胞株的快速凋亡。这种TRAIL蛋白诱导的细胞凋亡并不发生在正常的细胞系中，最近完成的临床III期实验显示，重组人类TRAIL蛋白（rhTRAIL)在中国已经显示出对癌症有良好的治疗效果并且对其他细胞没有明显的毒性。然而，某些类型的肿瘤细胞对TRAIL蛋白的不敏感导致了 TRAIL蛋白疗法治疗失效。它本质上是DR4 / DR5在各种类型的白血病细胞表面表达水平的不同，产生了其对TRAIL蛋白的敏感性的变化。因此，在以DR4 / DR5为基础对白血病进行个性化治疗过程中，发展定量检测细胞膜表面DR4 / DR5表达的新方法非常重要。目前，最常用的方法为DR4/ DR5检测的免疫印迹分析和流式细胞术，通常只提供相对浓度或分布，不是在白血病细胞表面DR4 / DR5的确切数量或其表达动力学[参见：(ο) Kurita, S. ; Mott, J. L. ; Almada, L. L. ; Bronk, S. F. ; Werneburg, N. ff. ; Sun,S.Y. ; Roberts, L. R. ; Fernandez-Zapico, Μ. Ε. ; Gores, G. J. , Oncogene 2010, 29(34)，4848-4858. (p) Park, S. J. ; ffu, C. H. ; Choi, M. R. ; Najafi, F. ; Emami, A.;Safa, A. R. , Biochemical Pharmacology 2006, 72 (3)，293-307·]。同这些方法相比，电化学方法具有高灵敏度、固有的简单性、低成本、能很快转化为定量生物测定法实现临床应用等吸引人的优势，在电化学细胞传感过程中利用多功能纳米探针也可以排除的其它现有方法通常需要的细胞溶菌作用、标记细胞或复杂的仪器。但至今尚未有基于 Fe3O4/Au复合纳米结构的电化学细胞传感器对白血病细胞及其表面死亡受体的表达进行选择性定量分析方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于四氧化三铁/金复合纳米结构的电化学细胞传感器，可以对白血病细胞及其在细胞表面上DR4 / DR5死亡受体的表达进行高灵敏的选择性定量分析。本专利技术的技术方案如下： 一种纳米结构电化学细胞传感器的制法，所述的纳米结构的电化学细胞传感器，它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成，如图I所示，其制法包括如下步骤： 步骤I.多功能混合纳米探针的制备： 取I. 35 g六水合三氯化铁，3. 2 g无水醋酸钠和0. 5mL聚丙烯酸(数均分子量：3000)加入到38mL乙二醇超声混合后，将混合物在473 K下水热反应6小时后进行磁分离、洗涤、干燥后得黑色磁性Fe3O4纳米球，磁性Fe3O4纳米球直径为500 nm±20 nm,取Fe3O4纳米球10 mg分散于I mL去离子水中，加入1%邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA) ImL超声反应30分钟后在磁场下对产品进行分离，洗涤后得Fe304/roDA纳米复合材料；金纳米粒子(Au NPs)以四氯合金酸水溶液和柠檬酸钠通过脱氧反应获得，其直径为13 nm±2 nm ;搅拌下将金纳米粒子加至Fe3O4A3DDA纳米复合材料中，通过静电吸引作用使其与Fe3O4A3DDA纳米结合，吸附完全后金胶酒红色褪去后进行磁分离，再加入金纳米粒子重复上述操作数次直至加入金纳米粒子后溶液颜色不变为止，磁分离样品并重新分散在纯水中，得到Fe3O4/PDDA/AuNPs纳米复合材料；将上述所得悬浊液以0.1 M氢氧化钠溶液将pH调至9.0后，力口入I mg mL—1辣根过氧化物歧化酶50 μ L和50 μ L 20 μ g mL—1的重组人TRAIL蛋白，4°C下搅拌过夜后经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后即得到HRP-TRAIL-Fe3O4IgAu多功能混合纳米探针，如图2所示； 步骤2.细胞传感纳米电极接口的组装 将浓度为4.86 mM的四氯合金酸水溶液5 mL与5 mL聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM, G=4)的水溶液混合均匀至黄色褪去，使PAMAM的终端氨基与金生成络合阴离子，室温下将络合物与还原剂20 mM硼氢化钠溶液1.8 mL搅拌30分钟后，溶液颜色变为深红色即为上述的以树状聚合物稳定的金纳米粒子(Au DSNPs)，树状聚合物稳定的金纳米粒子直径为10 nm±2 nm，其在283 nm和5处有紫外吸收峰，如图3所示，将玻炭电极(直径3 mm)分别以粒径为0.3和0.05 μ m的氧化铝粉末进行机械抛光并超声清洁后，滴加5.0 mg mL—1的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的氮掺杂碳纳米管(PDCNx，将氮掺杂碳纳米管分散在体积比3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合物中超声3小时后离心洗涤至pH为7.0,分散至0.20% PDDA水溶液中使其浓度为0.5mg mL'超声反应30分钟后离心、洗净,分散于水中得到5.0 mg mL—1 PDCNx) 5 μ L至电极表面并在室温下干燥；将干燥后的电极浸入制好的Au DSNPs溶液中I小时后，室温下浸入2.5%戊二醛溶液I小时后以磷酸盐缓冲液(ρΗ=7.4)冲洗，吹干；滴加5 μ L的HL-60细胞特异性识别适配体(KH1C12适配体)(5 μ Μ)，或5 μ L抗⑶3单克隆抗体(5μΜ) 4°C过夜培养后以磷酸盐缓冲液(ρΗ=7.4)小心冲洗，即在电极表面组装完成细胞传感纳米电极接口。上述的纳米结构电化学细胞传感器的制法，所述的细胞传感纳米电极接口的组装，所用层层组装多功能混合纳米探针过程以zeta电位仪测定其组装过本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米结构电化学细胞传感器的制法，其特征是：所述的纳米结构的电化学细胞传感器它是由多功能混合纳米探针和纳米结构的电极接口两个组件构成，其制法包括如下步骤：步骤1. 多功能混合纳米探针的制备：取1.35 g六水合三氯化铁，3.2 g无水醋酸钠和0.5mL聚丙烯酸加入到38mL乙二醇超声混合后，将混合物在473 K下水热反应6小时后进行磁分离、洗涤、干燥后得黑色磁性Fe3O4纳米球，磁性Fe3O4纳米球直径为500 nm±20 nm，取Fe3O4纳米球10 mg分散于1 mL去离子水中，加入1%邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）1mL超声反应30分钟后在磁场下对产品进行分离，洗涤后得Fe3O4/PDDA纳米复合材料；金纳米粒子（Au NPs）以四氯合金酸水溶液和柠檬酸钠通过脱氧反应获得，其直径为13 nm±2 nm；搅拌下将金纳米粒子加至Fe3O4/PDDA纳米复合材料中，通过静电吸引作用使其与Fe3O4/PDDA纳米结合，吸附完全后金胶酒红色褪去后进行磁分离，再加入金纳米粒子重复上述操作数次直至加入金纳米粒子后溶液颜色不变为止，磁分离样品并重新分散在纯水中，得到Fe3O4/PDDA/AuNPs纳米复合材料；将上述所得悬浊液以0.1 M氢氧化钠溶液将pH调至9.0后，加入1 mg mL‑1辣根过氧化物歧化酶50 μL和50 μL 20 μg mL‑1的重组人TRAIL蛋白，4℃下搅拌过夜后经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后即得到HRP‑TRAIL‑Fe3O4@Au多功能混合纳米探针；步骤2. 细胞传感纳米电极接口的组装 将浓度为4.86 mM的四氯合金酸水溶液5 mL与5 mL 聚酰胺‑胺型树枝状高分子的水溶液混合均匀至黄色褪去，使PAMAM的终端氨基与金生成络合阴离子，室温下将络合物与还原剂20 mM硼氢化钠溶液1.8 mL搅拌30分钟后，溶液颜色变为深红色即为上述的以树状聚合物稳定的金纳米粒子（Au DSNPs），树状聚合物稳定的金纳米粒子直径为10 nm±2 nm，其在283 nm和5处有紫外吸收峰，将玻炭电极分别以粒径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉末进行机械抛光并超声清洁后，滴加5.0 mg mL‑1 的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的氮掺杂碳纳米管（PDCNx） 5 μL至电极表面并在室温下干燥；将干燥后的电极浸入制好的Au DSNPs溶液中1小时后，室温下浸入2.5%戊二醛溶液1小时后以pH=7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，吹干；滴加5μL的KH1C12适配体5μM,或5μL 抗CD3单克隆抗体5μM， 4℃过夜培养后以pH=7.4的磷酸盐缓冲液小心冲洗，即在电极表面组装完成细胞传感纳米电极接口。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱俊杰，华子春，郑婷婷，傅佳驹，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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