一种钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体1的融合蛋白及其制备方法和用途，本发明专利技术提供了小鼠钙网蛋白C区部分截除与可溶性程序性死亡受体1胞外段的融合蛋白CRT⊿-sPD1，并将该融合蛋白进行真核表达，建立了稳定表达CRT⊿-sPD1的细胞株且利用分泌肽使其分泌到细胞外。本发明专利技术的CRT⊿-sPD1融合蛋白具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；还能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，可作为肿瘤免疫治疗候选药物，用于治疗肿瘤等疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA重组技术和蛋白质药物领域，属于医药生物
，具体涉及钙网蛋白-程序性死亡受体I融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的载体或质粒、宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤等疾病中的应用。
技术介绍
I丐网蛋白(calreticulin, CRT)是一种高度保守的I丐结合蛋白，属于热休克蛋白家族，主要存在于内质网，具有多种生物学功能。CRT介导的免疫原性细胞凋亡 (immunogenic apoptosis)在抗肿瘤免疫中具有重要意义。有研究发现某些抗肿瘤治疗能诱导细胞的CRT从胞内向膜表面快速转位并在细胞膜上簇集，出现在凋亡细胞膜上的CRT可被DC细胞识别和吞噬。Obeid研究小组应用双向电泳筛选并鉴定了一系列具有使CRT膜簇集的诱导剂，如蒽环类药物(anthracyclines),奥沙利钼(oxaliplatin),紫外线和Y-射线。这些诱导剂在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，还使CRT从细胞内质网转移到细胞膜并呈簇集分布。这类凋亡的肿瘤细胞具有良好的免疫原性，应用这类凋亡的小鼠肿瘤细胞接种小鼠能诱导出强大的抗肿瘤免疫活性。多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞凋亡但不能使CRT发生膜转位和簇集，这类凋亡的肿瘤细胞也不具备肿瘤免疫原性。但将这类凋亡细胞包被重组的CRT蛋白，则可获得同样的抗肿瘤免疫效应，这些结果表明CRT分子的膜簇集是凋亡细胞具有免疫原性的关键因素。研究发现，凋亡的肿瘤细胞膜表面簇集的CRT能作为“吞噬我(eat-me) ”信号传递给DC，促使DC细胞活化并吞噬肿瘤细胞，DC在成熟的过程中加工并提呈肿瘤特异性抗原，从而诱导特异性CD4+和CD8+T细胞活化和增殖，由此产生对同种肿瘤的免疫杀伤活性。程序性死亡受体I (programmed cell death I,PD-1)及其配体F1D-Ll(programmedcell death I ligand I)是B7_⑶28家族的免疫共刺激分子，产生负向免疫调节作用，在机体的免疫稳定方面具有重要的生理功能。I3D-I主要表达于活化的淋巴细胞膜表面，PD-Ll与ro-i结合后诱导淋巴细胞的无能甚至凋亡，防止免疫反应的过度活化。但在肿瘤免疫研究中发现肿瘤细胞表面I3DLl的高表达，它与肿瘤组织内淋巴细胞上的ro-i结合后，将抑制效应性T细胞活性，同时降低后者IL-2和IFN- Y的表达和分泌，形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境，促进肿瘤的生长。阻断ro-1/PD-Ll相互结合的方法可用于肿瘤的免疫治疗。有学者应用ro-i胞外区(sro-ι)的原核表达蛋白或者sro-ι的真核表达质粒处理荷瘤鼠，结果发现SPD-I蛋白不仅抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，增强肿瘤特异性CTL细胞的功能。应用ro-Ll抗体阻断ro-1/PD-Ll途径后，也能促进⑶8+T细胞增殖和细胞因子的分泌，诱导肿瘤的消退。应用人源化的ro-ι单克隆抗体进行肿瘤治疗已进入临床II期，并取得良好的抗肿瘤效果。这些结果提示阻断ro-i/PD-Li信号通路能达到有效的治疗肿瘤的目的。肿瘤的免疫逃逸是肿瘤得以发生、发展的关键因素，其中肿瘤诱导大量的免疫抑制分子构成的信号通路抑制了机体免疫系统对肿瘤组织的杀伤效应。鉴于sro-i具有阻断ro-1/PD-Ll、促进机体对肿瘤的免疫杀伤、及将CRT蛋白特异性包被在肿瘤细胞表面具有促进肿瘤特异性抗原提呈作用；因而本专利技术制备了小鼠钙网蛋白c区部分截短(Calreticulin, CRT」)与可溶性程序性死亡受体 I (programmed cell death I, F1Dl)胞外段(sroi)的融合蛋白CRT」-Sroi，并在小鼠黑色素瘤细胞B16-F1中分泌表达，使SPD-I与肿瘤细胞表面的I3DLI结合，阻断roi/roLi信号通路，同时使crt被包被在肿瘤细胞膜表面，使融合蛋白CRT」-Sroi同时获得两方面的抗肿瘤免疫作用，达到有效抗肿瘤的免疫调节功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种钙网蛋白-可溶性程序性死亡受体I的融合蛋白及其制备方法和用途。本专利技术所制备的CRT」-sPDl融合蛋白具有结合细胞表面ro-Ll及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；还能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤，抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期，可作为肿瘤免疫治疗候选药物，用于治疗肿瘤等疾病。 本专利技术的目的之一是提供一种新的融合蛋白，该融合蛋白包括以下元件1)钙网蛋白，或具有钙网蛋白活性的片段或变体；2)可溶性程序性死亡受体1，或具有可溶性程序性死亡受体I活性的片段或变体。更佳地，本专利技术所使用的钙网蛋白和可溶性程序性死亡受体I均来源于小鼠。其中，更好的，所述钙网蛋白的编码序列如SEQ ID NO: I所示，可溶性程序性死亡受体I的编码序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术还有一个目的提供一种分离的DNA分子，它编码本专利技术的融合蛋白。更好的，该DNA分子包括SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。本专利技术还有一个目的是提供包含上述DNA分子的质粒或载体、以及含有上述DNA分子或质粒或载体的宿主细胞。本专利技术还有一个目的是提供生产本专利技术的融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤1)提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白的核苷酸序列；2)在所述生物中表达所述核酸以形成所述融合蛋白；和3)分离或纯化所述融合蛋白。本专利技术还有一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白、或DNA分子、或质粒或载体、或宿主细胞。本专利技术还有一个目的是将本专利技术的融合蛋白、或DNA分子、或质粒或载体、或宿主细胞应用于制备药物，所述药物用于治疗肿瘤或免疫调节。本专利技术具体技术方案如下方法(I)利用分子克隆技术构建 pcDNA 3. I (+)/CRT」、pcDNA3. I (+)/sPDl 及pcDNA3. I (+) /CRT」-sPDl真核表达质粒。(2)将 pcDNA 3. I (+) /CRT」、pcDNA3. I (+)/sPDl、pcDNA3. I (+) /CRT」-sPDl 和pcDNA3. 1(+)(阴性对照)质粒转染則641细胞，通过G418筛选后，挑取阳性克隆扩大培养，western blot鉴定CRI\、sPDl、CRT」-sPDl在B16-F1细胞中表达，并利用ELISA法和流式细胞术(FCM)检测融合蛋白分泌到细胞上清，并能与细胞膜上高表达的TOLl结合。(3)建立稳定表达的细胞株上清与淋巴细胞混合共培养，MTT法检测融合蛋白对淋巴细胞增殖能力的影响；将CFSE染色后淋巴细胞与稳定表达细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况及乳酸脱氢酶法检测致后敏淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤作用。(4)动物实验；表达重组蛋白的细胞株接种于小鼠右背部皮下，观察肿瘤的生长，肿瘤鼠的生存期及抑瘤率；并取各组小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞株共培养，流式细胞术检测淋巴细胞的增殖和特异杀伤性淋巴细胞数(⑶8+和INF-γ双阳性)，乳酸脱氢酶法检测淋巴细胞杀伤作用及ELISA法检测淋巴细胞培养上清中分泌INF-Y量；由此判定融合蛋白的抗肿瘤作用的免本文档来自技高网...
【技术保护点】
融合蛋白CRT⊿？sPD1，其特征在于，该融合蛋白包括以下部分：1）钙网蛋白，或具有钙网蛋白活性的片段或变体；2）可溶性程序性死亡受体1，或具有可溶性程序性死亡受体1活性的片段或变体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘朝奇，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：
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