本发明专利技术公开了一种猪源A型流感病毒头部蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。使用本发明专利技术所提供的方法可以提高流感病毒HA的产量，每两升培养基可以得到纯化的HA蛋白大于200毫克。只需5-6天即可得到一批纯化的蛋白，缩短生产时间。此外，由于不会使用流感病毒因此可以保证疫苗的生物安全性，不会出现散毒的危险，而且不需要鸡胚扩增病毒大大降低了生产成本，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种流感病毒蛋白及其制备方法和应用，特别是一种高表达量的功能性猪源A型流感头部蛋白。
技术介绍
流行性感冒(简称流感)(influenza)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病。流感病毒在病毒分类上属于正粘病毒科。按照病毒核蛋白(nucleocapside protein, NP)和基质蛋白(matrix protein)的特征，流感病毒分为甲(A)、乙(B)和丙(C) 3个型。根据病毒颗粒表面血凝素(hamagglutinin，HA)和神经氨酸酶( neuraminidase, NA)蛋白抗原性的差别，甲型流感病毒又可进一步分为不同的亚型。目前所发现的甲型流感病毒有16个HA亚型，9个NA亚型。甲型流感病毒于1901年被发现，然而， 人甲型流感病毒直到1933年才被分离出来，它常以流行形式存在，能造成世界性流感大流行。自人流感病毒被发现以来，人甲型流感病毒曾出现过数次亚型毒株即1957年的H2N2 亚型，也称亚洲流感；1968年的H3N2亚型，也称香港流感；1977年的Hmi亚型，也称俄罗斯流感，它们均首发于我国。1997年和1998年在我国香港特别行政区及内地还发现了禽 H5N1和H9N2流感病例。同时，1998年以来WHO每年所公布的流感病毒疫苗株中大多数来自中国。因此，我国被世界公认为流感的多发地。流感病毒的编码产物共有10种蛋白，其中RNA聚合酶有3种，分别为PB1，PB2和PA。 核蛋白(NP)，Ml和M2蛋白、NSl和NS2蛋白以及血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。除NSl 和NS2为非结构蛋白外，其余均为结构蛋白。甲型流感病毒粒表面有3种结构蛋白，即HA、 NA和M2。HA首先在细胞内质网合成分子量为76kD，含有562-566个氨基酸的HA蛋白前体 (HAO)，随后HAO分子水解成HAl (47kD)和HA2 U9kD)两个多肽，前者含有319-3 个氨基酸，后者含有221-222个氨基酸，两者间靠二硫键相连形成具有典型的I型膜蛋白结构的 HA分子。HA蛋白的大部分位于膜外，近HA2羧基末端的疏水区穿过双层类脂膜，将HA分子镶嵌在膜上。利用X射线衍射技术证实，流感病毒的HA蛋白以三聚体的形式存在于双层类脂膜上，即由3个非共价结合的HA蛋白单体所组成。HA蛋白三聚体可分为呈杆状的基底部和呈球状的头部。病毒的受体结合部位呈浅口袋状，位于HA蛋白的头部，受体结合部位的氨基酸组成在不同亚型病毒HA蛋白中高度保守。HA在病毒复制中起重要作用，它识别并结合宿主细胞表面上的受体，能使病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合，并能刺激机体产生保护性中和抗体。NA在新合成病毒粒释放过程中起重要作用，它能防止新合成病毒粒相互聚集在宿主细胞表面，无法释放再去感染新的宿主细胞。它的抗体能减少病毒排泄量和噬斑形成量，但不能中和病毒感染性。M2则起离子通道作用，能使Ml膜打开，病毒RNP (核糖体蛋白)进入胞浆。其余结构蛋白均在病毒粒内部，无法刺激机体产生保护性抗体。HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一，其抗体能中和流感病毒的感染，是主要的保护性抗体。分子流行病学研究的结果证明，流感病毒HA基因，主要是HAl编码区在持续不断地、快速的发生突变。造成HA基因快速变化的原因包括其RNA基因本身的快速改变及人群自然选择压力两种因素，前者是由于病毒RNA多聚酶缺少DNA多聚酶所具有的审阅功能，不能纠正RNA复制中的错误，是子代病毒的基因不完全忠实于亲代病毒。后者指人群特异性免疫对HA蛋白进化的作用。当今预防流感的最有效手段仍是流感病毒疫苗的接种，对于流感疫苗的研究从上世纪30年代起就开始进行。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产疫苗成为可能。流感病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用。1943年美国开始在军队使用，并证实有效。1945年开始在美国广泛应用。这种早期粗制的疫苗，使用含流感病毒粒的鸡胚尿囊液，经红细胞吸附和释放，进行有限的纯化，然后加强灭活。接种疫苗后，局部和全身的反应都很强。20世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使病毒粒纯化操作大大提高，制成了纯化全病毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。如用裂解的纯化疫苗，不良反应就大为减少。1968年美国首次批准使用裂解疫苗。20世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位(HA和NA)疫苗。在英国使用证实了免疫效果与裂解苗相同，并可用于儿童。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其他国家。为了进一步提高疫苗产量，降低成本，研究出了高产的重配疫苗株。如用在实验室长期适应的A/ PR/8/34(HlNl) (PR8)毒株与野毒株进行重配的疫苗株。这样重配的疫苗株不但具备野毒株的表面抗原(HA和NA)，同时也获得PR8毒株在鸡胚中的复制能力。近来还应用基因克隆技术,在杆状病毒丝蚕系统(baculovirus silk worm system)中获得大量高纯度、高效价的流感毒粒HA亚单位。随着分子生物学的飞速发展，促进了基因工程和蛋白质工程技术的建立。分子生物学的飞速发展，促进了基因工程和蛋白质工程技术的建立。运用此类技术对疫苗进行了多方面的研究。沿着这个方向，流感疫苗已有下列开拓性工作。有人研制NP、 Ml和M2疫苗，因它们抗原性保守并具有型的特异性，故刺激机体所产生的抗体在不同亚型毒株间有交叉保护，具广谱性，不必随流行毒株抗原性变异而改变，但它们目前仍处于试验阶段。MDP-微毒粒疫苗是利用佐剂来提高免疫效果的，日本已开始在志愿者中使用。该疫苗的抗体阳转率较为理想，但有不良反应。近年来发展一种流感DNA疫苗，其不但能使机体产生保护性抗体还产生强烈的细胞应答。但至今仍较一致认为DNA疫苗仍处于婴儿时期， 许多问题仍有待解决。我国生产流感疫苗主要是通过鸡胚培养扩增病毒，而后收集尿囊液中的病毒进行灭活处理，然后与免疫佐剂混合制备成全病毒灭活疫苗。其在生产过程中面临生产周期长生产成本高的问题，而且在生产过程中需要大量的SPF鸡胚。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种猪源A型流感病毒蛋白。所述流感蛋白为(a)或(b)的蛋白质(a)有SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有流感蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种产所述流感蛋白的基因工程菌。所述基因工程菌为大肠杆菌BL21。所述基因工程菌使用分泌型表达载体，所述表达载体为pET系列。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种制备所述流感蛋白的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的具体技术方案为(1)根据GenBank:FJ966082. 1序列，人工合成编码SEQ ID NO. 1所述蛋白质的核苷酸序列 SEQ ID NO. 4 ；(2)将步骤(1)中得到的核苷酸片段克隆到表达载体pET21a;(3)将步骤2得到的表达载体转化大肠杆菌BL21；(4)诱导表达权利要求1所述蛋白质；(5)纯化步骤(4)得到的蛋白质，得到大量包涵体；(6)将步骤(5)得到的包涵体进行复性处理，制备有活性的病毒蛋白。所述复性条件为lmL dissolution bu本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪源Ａ型流感病毒头部蛋白，其特征在于如（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的氨基酸组成的蛋白质；（ｂ）在（ａ）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有流感蛋白抗原性的由（ａ）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种猪源A型流感病毒头部蛋白，其特征在于如(a)或(b)的蛋白质(а)由SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质；(b )在(a )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有流感蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。2.一种产权利要求1所述流感蛋白的基因工程菌，其特在在于所述基因工程菌为表达 SEQ ID NO. 1所示蛋白质的大肠杆菌BL21。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特在在于所述工程菌使用分泌型表达载体。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pET系列。5.一种制备权利要求1所述病毒蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据GenBank:FJ966082. 1序列，人工合成编码SEQ ID NO. 1所述蛋白质的核苷酸序列 SEQ ID NO. 4 ；(2)将步骤(1)中得到的核苷酸片段克隆到表达载体pET21a;(3)将步骤( 得到的表达载体转化大肠杆菌BL21；(4)诱导表达权利要求1所述蛋白质；(5)纯化步骤(4)得...
【专利技术属性】
技术研发人员：高福，宣春玲，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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