用于疫苗的高滴度重组流感病毒制造技术

本发明专利技术提供了对于制备高滴度流感病毒有用的组合物，例如在没有辅助病毒的情况下，其包括来自在有胚鸡蛋或ＭＤＣＫ细胞中复制到高滴度的流感病毒分离物的至少五个内部基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于疫苗的高滴度重组流感病毒相关申请的交叉引用本申请要求2006年3月31日提交的美国申请系列号NO.60/787,766的提交日期的权利，其公开内容通过引用合并在此。政府支持本专利技术是在来自国家卫生研究所的拨款编号AI044386的政府支持下做出的。在本专利技术中美国政府拥有某些权利。背景阴性-正义RNA病毒被分类为七个科(弹状病毒科(Rhabdoviridae)，副粘病毒科(Paramyxoviridae)，丝状病毒科(Filoviridae)，博尔纳病毒科(Bornaviridae)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，其包括常见的人类病原体，例如呼吸道合胞体病毒、流感病毒、麻疹病毒和埃博拉(Ebola)病毒，以及对家禽和家畜产业具有重要经济影响的动物病毒(例如，新城疫病毒和牛瘟病毒)。前四个科的特征在于非片段化的基因组，而后三个科具有分别包括六到八个、三个或两个阴性-正义RNA片段的基因组。阴性-正义RNA病毒的一般特征是它们的RNA基因组的阴性极性；即，病毒RNA(vRNA)是与mRNA互补的，因而本身不是传染性的。为了启动病毒转录和复制，vRNA必需通过病毒聚合酶复合物和核蛋白分别转录成正链(plus-sense)mRNA或cRNA；对于A型流感病毒，病毒聚合酶复合物包括三种聚合酶蛋白质PB2、PB1和PA。在病毒复制期间，cRNA充当了新的vRNA分子的合成的模板。对于所有的阴性链RNA病毒，在vRNA和cRNA的5′和3′末端的非编码区域对于病毒基因组的转录和复制都是关键的。不同于细胞或病毒mRNA转录产物，cRNA和vRNA都既不在5′末端帽化也不在极3′末端多聚腺苷化。许多病毒蛋白质的基本功能已经生物化学地和/或在病毒感染的环境中阐明了。然而，反向遗传学系统已经显著地增进了我们对阴性链片段化和非片段化RNA病毒关于它们的病毒复制和致病性、以及关于活体减毒病毒疫苗开发的认识。作为在分子病毒学中使用的术语，反向遗传学被定义为产生具有来自克隆的cDNA的基因组的病毒(综述参见Neumann等，2002))。为了启动阴性链RNA病毒的病毒复制，vRNA或cRNA必须与聚合酶复合物和核蛋白共同表达。狂犬病病毒是第一种完全从克隆的cDNA产生的非片段化的阴性-正义RNA病毒：Schnell等(1994)通过编码全长cRNA的cDNA构建体和L、P和N代表的蛋白质表达构建体的共转染，都处在T7RNA聚合酶启动子的控制下，产生了重组狂犬病病毒。用提供了T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染，引起了传染性的狂犬病病毒的产生。在这个T7聚合酶系统中，处在T7RNA聚合酶的控制下的全长cRNA的最初的转录产生了非帽化的cRNA转录产物。然而，形成T7RNA聚合酶的最佳的起始序列的三个胍核苷酸附着在5′末端。为了产生对于生产性传染性周期必须的cRNA转录产物的可信的3′末端，肝炎Δ核酶(HDVRz)序列被用于在cRNA转录产物的3′末端精确地自动催化裂解。自Schnell等(1994)的初步报告开始，利用类似技术的反向遗传学系统引起了许多非片段化阴性链RNA病毒的产生(Conzelmann，1996；Conzelmann，1998；Conzelmann等，1996；Marriott等，1999；Munoz等，2000；Nagai，1999；Neumann等，2002；Roberts等，1998；Rose，1996)。最初的拯救操作的改进包括从稳定转染的细胞系(Radecke等，1996)或从蛋白质表达质粒(Lawson等，1995)的T7RNA聚合酶表达，或热激操作来提高拯救效力(Parks等，1999)。根据T7聚合酶系统，Bridgen和Elliott(1996)从克隆的cDNA产生了布尼奥罗病毒(Bunyaviridae科)，并展现了通过T7聚合酶系统人工地产生片段化的阴性-正义RNA病毒的可能性。在1999年，基于细胞RNA聚合酶产生了基于质粒的反向遗传学技术，用于完全从克隆的eDNA产生片段化的A型流感病毒(Fodor等，1999；Neumann和Kawaoka，1999)。核仁酶RNA聚合酶I合成核糖体RNA，其象流感病毒RNA一样，不含有5′帽或3′polyA结构。侧翼是RNA聚合酶I启动子和终止子序列的、含有流感病毒cDNA的构建体的RNA聚合酶I转录引起了流感vRNA合成(Fodor等，1999；Neumann和Kawaoka，1999；Neumann和Kawaoka，2001；Pekosz等，1999)。该系统是高效的，转染后48小时产生了质粒转染的细胞的每毫升上清液超过108个传染性病毒颗粒。需要的是完全地从克隆的eDNA制备高滴度的正粘病毒例如A型流感病毒的方法。专利技术概述本专利技术提供了包含本专利技术的多种流感病毒载体的组合物，例如，对于制备重配体(reassortant)病毒有用的那些，包括7:1重配体，6:1:1重配体、5:1:2重配体和5:1:1:1重配体。在本专利技术的一个实施方式中，所述组合物包括用于vRNA产生的载体，所述载体选自包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2eDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAeDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPeDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NSeDNA可操作地连接的启动子的载体。所述组合物还包括用于病毒蛋白质产生的载体，所述载体选自编码流感病毒PA的载体、编码流感病毒PB1的载体、编码流感病毒PB2的载体和编码流感病毒NP的载体，以及任选地编码NP、NS、M例如M1和M2、HA或NA的一种或多种载体。优选的，编码病毒蛋白质的载体进一步包括转录终止序列。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任选的NA的eDNA具有来自在有胚蛋中复制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任选的NA的序列，HA的cDNA具有来自不同的流感病毒毒株的序列(来自具有相同或不同HA亚型，即，异源HA的异源流感病毒分离物)。对于来自在有胚蛋中不生长到高滴度的病原性H5N1病毒的HA，至少NA的cDNA具有在有胚蛋中复制到高滴度的N1流感病毒的序列。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括与一序列(多核苷酸)相应的核酸分子，所述序列编码高滴度的，例如大于108EID50/mL，例如109EID50/mL、1010EID50/mL或更高的滴度流感病毒的至少一种蛋白质。在有胚蛋中具有高滴度的本专利技术范围内的重配体，对于5:1:1:1重配体(具有NSK55)、5:1:2重配体(具有NSK55)和6:1:1重配体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含７：１重配体的多种流感病毒载体，包含　ａ）包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＰＡ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＰＢ１　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止 序列的流感病毒ＰＢ２　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＨＡ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＮＰ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＮＡ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒Ｍ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒ＮＳ　ｃＤＮＡ可操作地连接的启动子的载体，其中ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ和ＮＳ的ｃＤＮＡ具有来自在有胚蛋或ＭＤＣＫ细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ和ＮＳ的序列，并且其中所述ＨＡ的ｃＤＮＡ具有异源ＨＡ的序列；以及　ｂ）包含与编码流感病毒ＰＡ的ＤＮＡ片段可操作连接的 启动子的载体、包含与编码流感病毒ＰＢ１的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒ＰＢ２的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、以及包含与编码流感病毒ＮＰ的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒ＨＡ的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒ＮＡ的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒Ｍ１的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒Ｍ２的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒ＮＳ２的ＤＮＡ片段可操作连接的启动子的载体。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-3-31 60/787,7661.一种组合物，其包含用于制备重配体流感病毒的多种A型流感病毒载体，包含a)包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：1编码的多肽的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：2编码的多肽的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：3编码的多肽的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：4编码的多肽的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：5编码的M1和M2的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，以及包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：6编码的NS1和NS2但其中所述NS1在位置55具有Glu残基的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，其中HA的cDNA具有异源A型流感HA序列；其中NA的cDNA具有异源A型流感NA序列；并且任选地，其中HA和NA来自不同的分离物；以及b)包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、以及包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体。2.一种组合物，其包含用于制备重配体流感病毒的多种A型流感病毒载体，包含a)包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：1编码的多肽的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：2编码的多肽的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：3编码的多肽的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：4编码的多肽的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：5编码的M1和M2的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，以及包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：6编码的NS1和NS2但其中所述NS1在位置55具有Glu残基的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的用于vRNA生产的载体，其中HA的cDNA具有H5HA序列；其中NA的cDNA具有异源A型流感NA序列；并且任选地，其中HA和NA来自不同的分离物；以及b)包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、以及包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的用于病毒蛋白生产的载体。3.权利要求1或2的组合物，其中所述启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T3启动子或T7启动子。4.权利要求1或2的组合物，其中a)的多种载体包含RNA聚合酶I启动子或RNA聚合酶II启动子。5.权利要求1或2的组合物，其中b)的所有载体包含RNA聚合酶II启动子。6.权利要求1或2的组合物，其中a)的每种载体或b)的每种载体处在独立的质粒上。7.权利要求1或2的组合物，其中所述NA或HA是嵌合的NA或HA。8.权利要求1或2的组合物，其中NA中茎部的长度大于20个氨基酸。9.权利要求2的组合物，其中所述HA是无毒力的H5HA。10.权利要求1或2的组合物，其中所述NA是N1。11.权利要求3的组合物，其中所述RNA聚合酶I启动子为人RNA聚合酶I启动子。12.一种制备A型流感病毒的方法，其包括以有效产生传染性流感病毒的量用以下接触细胞：包含与连接到转录终止序列的编码由SEQIDNO：1编码的多肽的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：村上晋，河冈义裕，堀本泰介，
申请(专利权)人：沃弗威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]