本发明专利技术涉及一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，该病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC?NO：V201031。该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，经删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个基因，并利用E3gp-19K启动子控制表达人IL12的p35和p40亚基基因序列。该病毒通过感染肿瘤细胞在肿瘤细胞中复制溶解肿瘤细胞同时，能在肿瘤组织中产生高水平具有多种抗肿瘤作用的hIL12。hIL12具有抗肿瘤血管形成作用，能调节人体免疫能力，使机体产生抗肿瘤特异免疫能力，杀死远处转移肿瘤细胞并可防止肿瘤复发，可作为一种靶向性基因工程药物治疗各种实体瘤，不但可用于肿瘤内注射，还可用于腹腔、胸腔内注射，均不会引起明显副作用，具有较好的疗效和安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程生物
，特别是涉及一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用。
技术介绍
基因工程腺病毒载体Ad-TD是一种肿瘤靶向性载体，经过删除E1A-CR2、EIB19K和 E3gp-19K三个基因，并保留E3gp-19K启动子序列的5型腺病毒，具有很好的抗肿瘤效果。 白介素12 (IL12)被称为自然杀伤细胞刺激因子或者细胞毒性淋巴细胞成熟因子，是由二硫键连接的异二聚体的细胞因子，两个亚基通常称为P35和p40。p35由T细胞、B细胞、NK 细胞及单核细胞等产生；P40主要由活化的单核细胞及B细胞产生。人和小鼠的p35和p40 基因已经被测序，并且它们在体内外显示出NK细胞和T细胞的生长因子的功能。进一步研究表明，IL12能有效地使小鼠肿瘤消退和完全消失。但是，IL12在体内有很短的半衰期， 需经持续注射才能够达到治疗效果，需要IL12的量相对较大(1-10 μ g/天)，并且给予重组的IL12蛋白经常导致严重毒性。目前，利用逆转录病毒载体的IL12基因治疗在一些实验室中正在进行，其抗肿瘤效果已经被证实，但是，直接运用IL12基因治疗还不能引起建立的肿瘤和肿瘤自发转移灶的消退。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种靶向性治疗人肿瘤的腺病毒Ad-TD_hIL12， 该病毒可作为治疗肿瘤的基因工程药物，该病毒载体具有靶向性、安全、高效的特点。本专利技术的技术方案5型腺病毒载体为含有编码人IL12的p35和p40亚基基因的复制选择型腺病毒，该病毒能选择性地在肿瘤细胞中复制，并在进入肿瘤后表达有功能的人IL12。这些肿瘤包括裸眼能看到或者显微镜下可见的实体瘤、转移瘤和扩散瘤。该病毒载体进入机体后能够选择性地在肿瘤细胞中复制并溶解肿瘤细胞，释放大量肿瘤相关抗原，与表达的细胞因子人 IL12协同作用，使机体产生高效、特异的抗肿瘤反应，杀伤未被病毒感染的远处肿瘤细胞， 包括转移的微小肿瘤细胞灶。在肿瘤细胞中高表达的IL12还具有抗肿瘤血管形成等多种作用。为了解决上述问题，本专利技术构建了一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD_hIL12，该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除该腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp_19K三个内在基因(Triple Deletion，TD)，保留了有助于病毒基因的表达和增强病毒在体内持续时间的BIBB基因，同时，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因——人白细胞介素12。白介素12是异二聚体，包括p35和p40亚基，每个亚基有各自的基因编码，IL12 的p35和p40亚基的编码DNA序列可以从包括人的组织中获得。本专利技术中的人IL12序列包括来源于人组织、体外合成或者重组的完整的和改变的具有抗肿瘤效果的编码序列。这些序列包括但不只限定在人IL12 DNA序列的增加、删除、点突变及5’和/或3’端的缺失。不同于本专利技术中的人IL12序列的同源DNA序列或者编码的多肽表现出抗肿瘤效果或者引起肿瘤消退的序列也包含其中。所述p35和p40亚基基因对应的氨基酸序列分别为SEQ NO :1和SEQ NO :2，对应的核苷酸序列分别为SEQ NO 3和SEQ NO :4。所述的人肿瘤为人的各种实体瘤。所述靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD_hIL12在用于制备治疗肿瘤药物中的应用。靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒的载体Ad-TD-hIL12的构建方法，包括以下步骤(1)用NcoI和NheI双酶切pORF-hIL-12质粒，然后用T4DNA聚合酶将切出的hIL12 基因片段补平，备用；(2)用平端酶单一切开腺病毒载体pAd-TD的E3gp-19K缺失区，将所述的hIL12基因按基因组一致顺序插入到病毒载体PAd-TD的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体；(3)将所述重组载体转染到293细胞中，生产所述的病毒载体Ad-TD-hIL12。本专利技术的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12，已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:V201031，保藏日期2010年12 月1曰。本专利技术的积极有益效果(1)本专利技术的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12，利用病毒内在基因的启动子，删除了 E1A-CR2、E1B19K和E3gp_19K三个腺病毒内在基因，保留了 E3区的部分基因，利用 E3gp-19K基因的启动子表达人的IL12基因作为治疗基因。该病毒通过特定靶向人肿瘤细胞中常见的Rb基因和抗凋亡基因的异常，能选择性地在肿瘤细胞中复制而不在正常细胞中复制，从而增加特异性和安全性，复制的病毒能溶解肿瘤细胞，同时能在肿瘤组织中产生高水平并具有多种抗肿瘤作用的IL12。(2)本专利技术的Ad-TD- hIL12表达的hIL12具有抗肿瘤血管形成的作用，更为重要的是能调节人体免疫力，并与在肿瘤细胞中复制的Ad-TD-hIL12产生协同作用，使机体产生抗肿瘤特异免疫能力，从而杀死远处转移的肿瘤细胞，并可防止肿瘤复发。经细胞学实验和动物试验表明，该病毒能选择性地杀死肿瘤细胞，清除部分免疫缺陷和无免疫缺陷鼠类的荷瘤，具有较好的疗效和安全性。(3)本专利技术的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD_hIL12，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，可作为一种靶向性基因工程药物，能治疗的肿瘤包括裸眼能看到或者显微镜下可见的实体瘤、转移瘤和扩散瘤，也可治疗晚期弥漫播散性肿瘤。(4)本专利技术的溶肿瘤腺病毒Ad-TD_hIL12，不但可用于肿瘤内注射，还可用于腹腔、 胸腔内注射，并且均不会引起明显的副作用。(5)本专利技术的靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD_hIL12，安全、高效，为作为一种肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下基础，将为肿瘤病人提供一种有效的治疗方法，将产生较好的社会效益和经济效益。附图说明图1 本专利技术的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD_hIL12、Ad-TD-gene、 /71520和对照病毒 Ad-TD-RFP的结构图。图2 本专利技术的病毒Ad-TD_hIL12和对照病毒对大负荷肿瘤的治疗效果。图3 不同剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤生长曲线。图4 不同剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤停止进展率。图5 不同剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤清除率。图6 低剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤生长曲线。图7 低剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤停止进展率。图8 低剂量Ad-TD_hIL12、对照病毒和 /71520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤清除率。图9 :Ad-TD-m/hIL12治疗荷瘤有免疫能力动物后所产生的肿瘤特异免疫能力。图10 不同剂量Ad-TD_hIL12对胰腺癌腹腔扩散治疗作用(其中1:PBS;2: Ad-TD-hIL12 1 X IO9 pt/次；3 :Ad-TD_hIL12 2. 5 X IO9 pt/次；4 :Ad-TD_hIL12 5 X IO9 pt/ 次)。其中图3、图4、图6、图7中的符号表示， :PBS ；夺 //本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）Ａｄ－ＴＤ－ｈＩＬ１２，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１０３１。
【技术特征摘要】
1.一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒(oncolytic adenovirus)Ad-TD_hIL12，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO :V201031。2.权利要求1中所述的靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，其特征是该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，经删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp_19K三个基因，并利用E3gp-19K启动子控制表达人IL12的p35和p40亚基基因序列。3.根据权利要求2所述的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，其特征是所述p35和p40亚基基因对应的氨基酸序列分别为SEQ NO :1和SEQ NO :2，对应的核苷酸序列分别为SEQ N...
【专利技术属性】
技术研发人员：王尧河，姜国忠，王鹏举，高冬玲，尼克莱蒙，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：41
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