编码B族链球菌粘着因子的核酸、B族链球菌的粘着因子和它们的用途制造技术

本发明专利技术涉及编码B族链球菌的粘着因子的核酸、B族链球菌的粘着因子及其用途。更具体地，本发明专利技术涉及为这种粘着因子并包含氨基酸序列的多肽，其中该氨基酸序列选自SEQ?ID?NO11到SEQ?ID?NO20，还涉及所述多肽用于生产疫苗的用途。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是专利技术名称为“编码B族链球菌粘着因子的核酸、B族链球菌的粘着因子和它们的用途”，国际申请日为2003年10月15日，国际申请号为PCT/EP2003/011436，进入中国国家阶段日期为2005年4月5日，中国申请号为200380101524.X的分案申请。本专利技术涉及编码细菌粘着因子的分离的核酸分子、细菌粘着因子和它们的各种用途。专利技术背景无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，或者B族链球菌(GBS)，是婴儿死亡的最主要的原因。GBS具有每年几千例的估计流行率，导致美国的年死亡率为约10％到15％(Schuchat，1998)。来自美国的研究表明每1000个活产1-2例的危险(Zangwill等人，1992)，不同的欧洲国家的发病率为每1000个活产0.24到1.26例(Carstensen等人，1985；Faxelius等人，1988)。在美国，高达30％的怀孕妇女在阴道或直肠中至少暂时携带GBS而无症状(Schuchat，1998)。这些妇女所生的婴儿在分娩过程中被GBS定居(Baker和Edwards，1995)。受感染的羊水或者阴道分泌物的吸入使得GBS进入肺中。该感染的通常表现包括菌血症、肺炎和脑膜炎(Spellerberg，2000)。甚至GBS脑膜炎的幸存婴儿也患有神经后遗症，包括耳聋、学习障碍，以及运动、感觉和认知损伤(Baker和Edwards，1995)。目前，临产时抗生素预防是预防GBS导致的新生儿疾病的推荐方法(Baker等人，1999)；然而，随着其他链球菌种中抗生素抗性的再现，在GBS中可能发生类似的困境。除了婴儿感染，GBS也是老年和免疫受损的人中的重要病原，其中侵染性GBS疾病的发生率为100,000人中约9例(Farley等人，1993)。这些感染中，死亡率可高达30％。一种重要的GBS毒性决定簇是类型-特异的荚膜多糖，其防止宿主补体因子C3b的沉积并从而抑制细菌的调理吞噬作用(opsonophagocytosis)(Rubens等人，1987)。迄今为止，已经鉴定了GBS中9种不同的荚膜血清型：Ia、Ib、和II到VIII(Wessels，1997)。目前正在基于临床相关的血清型荚膜多糖的开发针对GBS的多效价的缀合疫苗(Paoletti等人，1999；Baker等人，1999；Baker等人，2000；Paoletti和Kasper，2002)。然而，对于含有荚膜的缀合疫苗有许多技术困难需要克服：需要多种血清型，需要鉴定和验证适宜的蛋白质缀合物，并且需要处理与人组织的潜在交叉反应性(Korzeniowska-Kowal等人，2001)。使用GBS的细胞表面蛋白代表了对于针对这些细菌的疫苗开发，对荚膜多糖的有吸引力的备选方案。已经表明来自GBS的表面蛋白Sip、Rib、α和β赋予小鼠针对GBS感染的保护性免疫(Madoff等人，1992；Larsson等人，1997；Larsson等人，1999；Brodeur等人，2000)。还表明来自血清型V菌株的两种独特的表面蛋白在小鼠模型中保护小鼠免受GBS感染(Areschoug等人，1999)。最后，发现针对GBS C5a肽酶的抗体引起细胞的巨噬细胞杀伤(Cheng等人，2001)。GBS与其宿主的相互作用是一种复杂的过程，包括定居和上皮和内皮表面的穿透和免疫防御的逃避(Spellerberg，2000)。在链球菌中，已经表明血纤蛋白原结合在对宿主表面的粘附(Courtney等人，1994；Cheung等人，1991；Ni等人，1998；Pei和Flock，2001)-->和免受免疫系统破坏的保护(Courtney等人，1997；Thern等人，1998；Ringdahl等人，2000)中起着重要的作用。因此，一些研究已经着手研究A、C和G血清群的链球菌中血纤蛋白原结合的分子基础(Fischetti，1989；Meehan等人，1998；Vasi等人，2000)。血纤蛋白原是在血浆中以高浓度发现的一种330kDa糖蛋白(Fuss等人，2001；Mosesson等人，2001)。其是由通过二硫键连接在一起的Aα-、Bβ-和γ-链各两条组成的六聚体。血纤蛋白原是止血中的关键角色并且介导损伤处血小板粘附和聚集。此外，其被凝血酶切割形成血纤蛋白，其是血凝块的主要成分。血纤蛋白原在调理吞噬作用中也起作用。已经表明其抑制活化的补体因子C3b的结合，从而阻碍补体旁路的活化(Whitnack等人，1984；Whitnack和Beachey，1985)新生儿对弥散的GBS感染的独特敏感性与相对补体缺乏有关(Mills等人，1979；Edwards等人，1983)。从而GBS的血纤蛋白原结合在新生儿中残余补体活性的抑制中起着重要作用(Noel等人，1991)。在一些研究中，已经阐明了GBS与人血纤蛋白原的相互作用(Schonbeck等人，1981；Lammler等人，1983；Chhatwal等人，1984；Spellerberg等人，2002)。然而，GBS中血纤蛋白原结合的分子基础仍然未知。已经阐明GBS结合并侵染上皮和内皮细胞(Gibson等人，1993；LaPenta等人，1997；Winram等人，1998)。用蛋白酶胰蛋白酶处理GBS除去了细菌的粘附和侵染性质(Valentin-Weigand和Chhatwal，1995；Winram等人，1998)，表明GBS中粘附素和侵染素的蛋白质本质。由于粘附素和侵染素位于细菌的表面并且对于GBS的毒性是重要的，所以它们代表GBS疫苗开发的理想靶标。本专利技术的问题是提供开发如针对细菌感染的疫苗的药物的方法。更具体地，该问题是提供可用于所述药物生产的GBS的新粘着因子。在第一方面中，通过优选编码血纤蛋白原-结合-多肽或这种蛋白或者其片段的分离的核酸分子解决了该问题，该分离的核酸分子含有选自包含下面的组的核酸序列：a)具有与选自SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 6的核酸序列至少70％同一性的核酸，b)与a)的核酸基本互补的核酸，c)含有a)或b)的核酸的至少15个连续碱基的核酸，d)在严格杂交条件下与a)、b)或c)的多核苷酸退火的核酸和e)如果没有遗传密码简并性，将与a)、b)、c)或d)中定义的核酸杂交的核酸。在第二方面，通过优选编码粘着因子或者其片段的分离的核酸分子解决了该问题，该分离的核酸分子含有选自下面组的核酸序列：a)与SeqID NO 7、SeqID NO 8、SeqID NO 9或SeqID NO 10中提出的核酸序列具有至少70％同一性的核酸，b)与a)的核酸基本上互补的核酸，c)含有a)或b)的核酸的至少15个连续碱基的核酸，d)在严格杂交条件下与a)、b)或c)的核酸退火的核酸，和e)如果没有遗传密码简并性，将与a)、b)、c)或d)中定义的核酸杂交的核酸。在本专利技术的两个方面的一个实施方案中，同一性为至少80％，优选至少90％，更优选100％。在本专利技术的两个方面的另一个实施方案中，核酸是DNA。-->在本专利技术的两个方面的另一个实施方案中，核酸是RNA。在本专利技术的两个方面的一个优选实施方案中，从细菌分离核酸分子。在本本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离的核酸分子，其优选编码粘着因子或者其片段，其含有选自包含下面的组的核酸序列：ａ）与ＳｅｑＩＤ　ＮＯ　７、ＳｅｑＩＤ　ＮＯ　８、ＳｅｑＩＤ　ＮＯ　９或ＳｅｑＩＤ　ＮＯ　１０中提出的核酸序列具有至少７０％同一性的核酸，ｂ）与ａ）的核酸基本上互补的核酸，ｃ）含有ａ）或ｂ）的核酸的至少１５个连续碱基的核酸，ｄ）在严格杂交条件下与ａ）、ｂ）或ｃ）的核酸退火的核酸，和ｅ）如果没有遗传密码简并性，将与ａ）、ｂ）、ｃ）或ｄ）中定义的核酸杂交的核酸。

【技术特征摘要】
2002.10.15 EP 02023141.1;2003.03.20 EP 03006393.71.一种分离的核酸分子，其优选编码粘着因子或者其片段，其含有选自包含下面的组的核酸序列：a)与SeqID NO 7、SeqID NO 8、SeqID NO 9或SeqID NO 10中提出的核酸序列具有至少70％同一性的核酸，b)与a)的核酸基本上互补的核酸，c)含有a)或b)的核酸的至少15个连续碱基的核酸，d)在严格杂交条件下与a)、b)或c)的核酸退火的核酸，和e)如果没有遗传密码简并性，将与a)、b)、c)或d)中定义的核酸杂交的核酸。2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中同一性为至少80％，优选至少90％，更优选100％。3.根据权利要求1或2的分离的核酸分子，其中该核酸分子编码含有至少一个重复的氨基酸基序的血纤蛋白原-结合-蛋白，所述氨基酸基序包含16个氨基酸。4.根据权利要求3的分离的核酸分子，其中所编码的血纤蛋白原-结合-蛋白含有19个重复的氨基酸基序，其中该氨基酸基序是权利要求7和15中任一项中指定的氨基酸基序。5.根据权利要求1或2的分离的核酸分子，其中该核酸分子编码与上皮细胞，优选人上皮细胞相互作用的粘着因子。6.一种编码多肽的分离的核酸分子，其中所述多肽含有氨基酸基序，其中所述氨基酸基序为G-N/S/T-V-L-A/E/M/Q-R-R-X-K/R/W-A/D/E/N/Q-A/F/I/L/V/Y-X-X-K/R-X-X(SEQ ID NO 222)。7.根据权利要求1到6任一项的核酸，其中核酸是DNA、RNA或其混合物，优选地该核酸分子从基因组DNA分离。8.一种载体，其含有根据权利要求1到7任一项的核酸分子。9.根据权利要求8的载体，其中该载体适于重组表达多肽，所述多肽由根据权利要求1到7任一项的核酸分子之一编码。10.一种细胞，优选宿主细胞，其含有根据权利要求8或9的载体。11.一种多肽，优选血纤蛋白原-结合-多肽和/或粘着因子，其含有氨基酸序列，其中该氨基酸序列由根据权利要求1到7任一项的核酸分子编码，和所述多肽的片段。12.一种多肽，优选血纤蛋白原-结合-多肽和/或粘着因子，其含有氨基酸序列，其中该氨基酸序列选自包含Seq ID NO 17-20的组。13.一种多肽，优选血纤蛋白原-结合-多肽和/或粘着因子，其含有氨基酸序列，其中该氨基酸序列选自包含Seq IDNO 205的组。14.一种多肽，优选血纤蛋白原-结合-多肽和/或粘着因子，其含有氨基酸基序，其中所述多肽包含氨基酸基序，其中该氨基酸基序是G-N/S/T-V-L-A/E/M/Q-R-R-X-K/R/W-A/D/E/N/Q-A/F/I/L/V/Y-X-X-K/R-X-X(SEQ ID NO 222)。15.一种产生根据权利要求11到14任一项的多肽或者其片段的方法，该方法包括表达根据权利要求1到7任一项的核酸分子。16.一种产生表达根据权利要求11到14任一项的多肽或者其片段的细胞的方法，该方法包括用根据权利要求8或9的载体转化或转染适宜的宿主细胞。17.一种药物组合物，特别是疫苗，其含有如权利要求11到14任一项中定义的多肽或其片段或者根据权利要求1到7任一项的核酸分子。18.根据权利要求17的药物组合物，其特征在于该药物组合物含有免疫刺激物质，其中该免疫刺激物质优选选自包括聚阳离子聚合物、免疫刺激性脱氧核苷酸(ODNs)、合成的KLK肽、神经活性化合物、alumn、弗氏完全或不完全佐剂或它们的...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·赖因爱德，H·古特孔斯特，A·舒伯特，B·J·艾克曼斯，A·迈因克，
申请(专利权)人：英特塞尔股份公司，
类型：发明
国别省市：AT