本发明专利技术属于重组蛋白表达纯化领域。本发明专利技术提供利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；(3)将步骤(2)中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；和(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。本发明专利技术还提供利用CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签结合内蛋白子在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括构建目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体，从而将融合表达的重组蛋白无外额外氨基酸的切出及纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组蛋白质表达中进行蛋白质纯化的方法，特别是采用亲和标签进行快速纯化的方法。更具体的说，本专利技术涉及利用无定形纤维素及其他纤维素为层析材料进行蛋白质纯化的方法。本专利技术还涉及用于蛋白质纯化的亲和标签的构建。本专利技术还涉及采用纤维素结合域在真核细胞中与重组蛋白融合表达以及快速纯化融合重组蛋白的方法。更具体地，本专利技术还涉及在真核生物中利用家族3纤维素结合域CBM3和内蛋白子(intein)将融合表达的重组蛋白无外额外氨基酸的切出及纯化的方法。
技术介绍
随着在制药和酶工业不断上升的重组蛋白质和酶的需求，快速而经济的重组蛋白质纯化方法在生物
一直是一个挑战。通过标准的层析方法获得相对纯的蛋白质常要求几个连续的层析步骤。这使得采用这一方法需要消耗大量时间而且产率不高。这个复杂的过程常常会延迟实验室中对新蛋白质的研究。在大规模制备工业和药用重组蛋白质时，下游的纯化过程费用很高，可高达总成本的80％[1]。在目前生物学研究中有许多重组蛋白质的纯化方法。通过各种亲和标记与树脂结合的亲和层析是最常用的蛋白纯化方法[2-4]。采用亲和层析纯化蛋白质的方法可以减少90％的费用，同时还可以减少纯化步骤，节约时间。引入亲和标记有时对目标蛋白质的生化特性还有促进作用。现有文献的报道表明亲和标记有下列优点：1)提高蛋白质产率[5，6]，2)避免被蛋白酶水解[7]；3)协助蛋白折叠[8，9]；4)保护重组蛋白的抗原性[10]；5)提高重组蛋白的可溶性。现在有许多亲和标记用于重组蛋白质的纯化。依据结合的树脂/层析柱的方式，它们可以分为几类：1)结合金属(例如，poly-His)；2)抗体(例如，FLAG，Protein A，HA，c-myc，T7-tag， GST等)：3)与树脂直接结合(例如，麦芽糖结合蛋白，几丁质结合域，纤维素结合域等)；4)其它的还有S-tag，streptag II等。亲和层析纯化中采用的树脂通常非常昂贵，价格也从几美元一毫升到几百美元一毫升[11，12]。如果说对于高附加值的蛋白质比如药用蛋白质还可以忍受的话，对一些低售价的非药物蛋白质比如工业用酶来说，这个代价是难以接受的[13]。即使对于高附加值的蛋白，人们也在致力于降低成本。发展简单，低成本和对环境友好的大规模重组蛋白质纯化体系还是一个挑战[2，14]。纤维素由于其具有下述优点，使其非常适合作为大规模亲和层析的树脂填料(matrix)：1).便宜，比如目前常用的微晶纤维素市场价约70元/kg；2).很好的物理特性，能够耐受高速离心、高柱压。3).惰性，不与蛋白质以及其他缓冲液中的常见物质反应；4).对于不带纤维素结合域(CBM)的蛋白质吸附能力很弱，吸附量非常低；5).有许多商业化的种类：棉花，布，滤膜，纤维素粉，纤维素纤维，纤维素小珠等；6).安全，在药物食品等领域作为填料、辅料已广泛使用[15]。与纤维素对应的亲和标记是纤维素结合域(CBM)。CBM是一个很有吸引力的蛋白-->质纯化亲和标记，因为其具有下述优点：1).CBM对纤维素的高特异性结合能力，吸附速度很快；2).能够耐受纯化中的变性和酶水解[16，17]；3).非特异性吸附很低；4).通过CBM吸附的蛋白质能在非失活条件下解离下来；5).CBM还能促进蛋白质折叠和分泌[18，19]；6).提高重组蛋白表达量[20]；7).提高融合蛋白稳定性[21]。采用CBM为亲和标记来纯化重组蛋白已经有了一些研究，详细的进展可以参考近期的综述[22，23]。使用的是一些结合能力/容量不高的商业化纤维素(Avicel，SigmaCell和无定形纤维素)[18，20，24-27]。不过大多数以CBM为基础的纯化系统是在大肠杆菌中构建的[28-30]，本专利技术人已在大肠杆菌中采用热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的家族3纤维素结合域(CBM3)构建了重组蛋白质的表达纯化体系[15，31]。许多时候，纯化的蛋白质用于进一步的应用时，尤其是用于医药目的的应用时，亲和标记需要被除去。有许多方法可以除去亲和标记，它们中的大多数采用蛋白酶切开目标蛋白和亲和标记之间的位点来切除亲和 标记。这个方法，通常需要添加昂贵的蛋白酶，而且需要增加除去添加的蛋白酶的步骤[32]。内蛋白子(Intein)是一种“蛋白质内含子”[33]，能够将它们自己切出来同时将其两端的蛋白质片度连接起来[34，35]。在将C-或N-末端的氨基酸替换后，内蛋白子可以通过特定pH或巯基试剂诱导自我拼切，将目标蛋白从亲和标记和内蛋白子上切下来。这个方法避免了蛋白酶的昂贵费用，简化纯化过程[34-36]。但是内蛋白子的缺点是在表达的过程中易发生自发的拼切导致最终表达产物中有许多在纯化前就丢失亲和标记而无法通过亲和柱纯化[15，31，37，38]。所以有效的控制内蛋白子的拼切在内蛋白子的应用中至关重要。在将融合蛋白结合到树脂上，洗去杂蛋白质前要尽量抑制内蛋白子的自发拼切，而在此之后又需要尽快使拼切发生，从而使目标蛋白切下来。目前的方法多为改变pH或添加巯基化合物。这些方法在大肠杆菌表达体系中，由于表达时间短(几小时)，表达中的自我拼切的损失还可以接受。而酵母中的表达，时间长(几十小时到几天)，如果不能控制内蛋白子的自发拼切，将极大影响下游纯化的得率。目前有许多内蛋白子抑制剂的研究和温度等条件型突变体也许可以解决这个问题。在酵母中的利用CBM为亲和标记还很少见，也不成系统。酵母与大肠杆菌相比有很多优点：酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰等不足，因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。但是只有几例CBM在酵母体系的报道。Ahn研究组和Rotticci-Mulder研究组都采用采用来源于丝状真菌的属于家族I的CBM(CBM1)与酯酶融合表达，大大促进了酯酶的分泌，但他们没有采用CBM1作为纯化的亲和标记[19，39]。家族I的CBM与纤维素的结合通常被认为可逆的，与纤维素结合的解离很快，不适宜用于作为蛋白质纯化的亲和标记。源于细菌的CBM，包括家族2和3的CBM2，CBM3，被认为在普通的缓冲液环境下与纤维素的结合是不可逆的，可作为亲和标记用于重组蛋白的表达纯化[28]。在酵母中CBM2的应用已进行了初步的研究，Kilburn研究组对将粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的CBM2a在 毕氏甲醇酵母(Pichia pastoris)中表达后，重组的CBM2a以及融合蛋白对纤维素的结合特性进行了研究，认为没有糖基化的CBM2a适合作为重组蛋白表达的亲和标记。对于家族III的CBM3还没有在酵母中应用的系统研究。本发-->明以CBM3为亲和标记，以再生无定形纤维素为纯化树脂建立了一个快速高效，低成本的重组蛋白表达纯化系统，并通过对EGFP的表达纯化进行了验证采用CBM与内蛋白子这两项技术结合的重组蛋白的体系，目前只有本专利技术人在大肠杆菌中构建的系统[31]，NEB公司在细菌中建立了一个几丁质结合域、内蛋白子与重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．利用家族３纤维素结合域ＣＢＭ３作为重组蛋白质表达的亲和标签在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：（１）构建所述真核生物密码子优化的编码ＣＢＭ３的核苷酸序列；（２）构建步骤（１）中的所述真核生物密码子优化的编码ＣＢＭ３的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；（３）将步骤（２）中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；（４）将步骤（３）中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；和（５）以ＣＢＭ３作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。
【技术特征摘要】
1.利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体；(3)将步骤(2)中构建的所述重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；和(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白。2.利用家族3纤维素结合域CBM3作为重组蛋白质表达的亲和标签结合内蛋白子在真核生物中表达和纯化重组蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(1)构建所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列；(2)构建步骤(1)中的所述真核生物密码子优化的编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列的重组构建体，并在编码CBM3的核苷酸序列与编码目标蛋白的核苷酸序列之间插入内蛋白子核苷酸序列，构建目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体；(3)将步骤(2)中构建的所述目标蛋白-内蛋白子-CBM3重组构建体克隆到适于在所述真核生物中表达的表达载体中；(4)将步骤(3)中获得的重组表达载体在所述真核生物中进行表达；(5)以CBM3作为亲和标签，利用纤维素纯化所表达的重组蛋白；和(6)诱导步骤(5)中纯化的重组蛋白中的内蛋白子进行自我剪切，得到不含CBM3的目标蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述家族3纤维素结合域CBM3包括来源于热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪泂，宛雯，高晓连，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34
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