口蹄疫的抗原化抗体疫苗制造技术

提供了治疗猪口蹄疫的疫苗，此疫苗是将得自ＦＭＤＶ的肽表位移植到猪抗体ＣＤＲ环而产生的抗原化抗体疫苗。可通过ＰＣＲ由ＦＭＤＶ的ＶＰ１基因克隆ＦＭＤＶ肽表位。使用重叠的ＰＣＲ法将ＦＭＤＶ肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的ＣＤＲ区域内，将所得的抗原化抗体基因克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至ＣＨＯ或骨髓瘤细胞，选择稳定的转染子细胞系以大量产生所需的蛋白质疫苗。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能引发抗口蹄疫之免疫力的疫苗。抗体是身体免疫系统对侵入体内的已知为抗原的外源物质作出反应而产生的蛋白质。疫苗可引发免疫应答，随即可保护宿主免受致病剂(抗原)的感染。通常，疫苗由致病生物体或其部分组成。组成疫苗的生物体或其某些部分经常是灭活的或减毒的以使宿主体内的致病生物体失去部分或全部的致病能力。在大多数情况下，当在体外培养细菌，和某种程度上为病毒时，它们会慢慢失去在生物体内生存并繁殖的能力。有多种方法可产生疫苗，大多数类型的疫苗包括病毒疫苗，生物药物疫苗，多抗原-肽疫苗和多蛋白疫苗。口蹄疫(下文也称之为FMD)是感染所有偶蹄动物的高传染性，严重导致衰弱的疾病。该病在世界上很多发展中国家流行，尤其是，亚洲的猪经常被FMD感染。FMD降低家畜的生产率，带来很高的免疫接种花费，限制了家畜和家畜产品的国际贸易。FMD是病毒传染性疾病，口蹄疫病毒(下文也称之为FMDV)是具有约8000个核苷酸长的单链有义RNA基因组的小的动物病毒。针对FMD已产生了两种主要类型的疫苗，它们是常规疫苗和合成的肽疫苗。抗FMDV的常规疫苗可使用灭活的FMD病毒或活的减毒FMD病毒。尽管常规疫苗方法一般是有效的，但还有几个相伴随的不符合要求的缺点。首先，它在花费上不合算。这一类型的疫苗由大量活的传染性病毒制成，维持和加工大量传染性病毒是昂贵的，费力的，还需占用大量空间。第二，也是最重要的缺点是这些疫苗具有潜在的危险性。最近几年大多数FMD的突然蔓延是由疫苗生产单位泄漏病毒引起的，或者是由使用未完全灭活或未充分减毒的病毒引起的。例如，本世纪80年代，包括意大利，英国，法国的欧洲国家发生了多次口蹄疫大流行，台湾于1996年也发生了口蹄疫大流行。由于经常发现导致口蹄疫流行的病毒与欧洲生产厂家所用的毒株密切相关或甚至相同，最初的口蹄疫大流行可能是由未充分灭活的疫苗或由疫苗生产厂泄漏的病毒引起的。另一个与生产常规疫苗相关的问题是它们是热不稳定的。当暴露于升高的温度中时，常规的FMD疫苗相对不稳定，不得不将它们置于低温中保存。持久地维持所需的低温经常是难以做到的，特别是在热带国家更是如此。常规疫苗生产方法之病毒培养方案中的另外一个潜在问题是使用胎牛血清病毒培养。疾病可能由胎牛血清传入并影响经免疫的动物。使用常规FMD疫苗的另一个主要缺点是使用常规方法产生的大多数疫苗是灭活的组织培养病毒的相对粗的制品。这种组织培养的混合物可导致严重的副作用，如变应性反应和易感家畜的流产。较新形式的FMDV疫苗不使用灭活的病毒。它们是合成的肽疫苗和重组蛋白疫苗。FMDV病毒蛋白1(VP1)上的免疫显性位点的鉴定为设计合成肽和重组蛋白FMD疫苗提供了新的思路。与常规疫苗相比，这两种类型的疫苗在生产和应用中都是安全的。它们也很容易处理，储存，运输，经设计能符合特殊的需要。在每个末端加上半胱氨酸残基之后，用戊二醛或空气氧化使VP1的141a.a.-160a.a肽聚合化，从而开始合成的FMDV肽疫苗研究，发现未偶联的肽可成为免疫原性的肽。1987年，Francis及其同事报道了具有游离巯基的C末端半胱氨酸的存在可大大增加游离的141-160a.a.肽的免疫原性。当加上多个半胱氨酸残基时也可得到类似的结果。这表明游离巯基半胱氨酸残基的存在可以形成导致更适宜的二级结构的肽二聚体，所述二级结构可在体内导致免疫复合物的形成(Francis，1995)。根据这一思路，将串联重复(Cys 137-162(×2))的免疫原性与单拷贝Cys 137-163肽的免疫原性相比较，发现串联重复的FMDV肽一般比单拷贝的二硫键二聚体的免疫原性更强。增加半胱氨酸残基可导致二硫键四聚体结构的形成，该结构可进一步改善免疫应答。使用Tam多抗原肽(MAP)系统(Tam 1988)进一步检测多拷贝合成肽的想法。该系统可以在分支赖氨酸骨架上固相合成肽抗原以产生几个多赖氨酸八聚体构建体。具有多拷贝肽的该系统导致大大增强的免疫应答。为了应用多拷贝FMDV肽，通过将小的肽序列与编码较大蛋白质的基因融合应用了重组DNA技术。这些较大的重组疫苗蛋白质具有多个特点。与通过化学交联制备的那些结构相比，将肽与载体连接的目的是提供完全均一和确定的结构以提供免疫原(Francis，1991)。首先使单或多拷贝的FMDV免疫原性肽与细菌蛋白质，β-半乳糖苷酶的N-末端融合以研究此方法(Broekhuijsen等，1986；Winther等，1986)。选择β-半乳糖苷酶的原因是已表明它可引发产生针对位于N末端的VP1表位的抗体，它也含有几个T细胞表位(Krzych等，1982；Manca等，1985)。已发现这个多拷贝FMDV肽-β-半乳糖苷酶重组蛋白的免疫原性与使用赖氨酸背景系统得到的(Broekhuijsen等，1987)相类似。然后，使用与乙肝病毒核心抗原(HBcAg)之N末端融合的FMDV肽序列进一步开发多个肽的提供以产生HBc融合颗粒。据报道这一27nm的杂合蛋白颗粒能完全保护豚鼠，其结果与灭活的FMDV VP1142a.a.-160a.a.肽所引发的相似，可保护动物免受攻击性感染。尽管最初是有希望的，但合成肽方法和重组蛋白疫苗方法似乎存在缺点，其中有三级结构的可预见性差和免疫原性弱。如果肽表现出其所需功能必需的三维水平上特定的构象的话，溶液中的肽却以不总是最适于受体结合(B细胞受体和可能是T细胞受体和主要组织相容性基因产物)的构象存在。在合成肽相对较小的情况下，注射后容易在体内降解。因此，它们在提供长期免疫应答方面不是很有效，这可能是因为重组蛋白疫苗不能表现出适当的构象。另外，肽合成是昂贵的，可导致疫苗的高生产花费。如上所述，通过与β-半乳糖苷酶或HBcAg类的微生物蛋白质之N末端融合可在肽疫苗上提供FMDV表位。然而，使用β-半乳糖苷酶可引发很多额外的和不必要的免疫应答(Bona等，1994)。用此重组蛋白疫苗重复免疫之后，可产生如即发性超敏反应的副作用，导致动物患严重的枯草热和气喘病。核酸疫苗或DNA疫苗代表着控制传染因子的新方法。这些新疫苗易于设计和制备。使用重组DNA技术将编码用作免疫原的一种或多种蛋白质的DNA序列克隆至真核表达载体中。抗原化抗体是其可变区经基因工程改造可表达不同抗原之表位的抗体。抗原化抗体可用作针对特异性B或T细胞表位产生免疫应答的免疫原。因此，抗原化抗体可用于替代常规或合成肽免疫接种法。因此，既可提供安全的可能性又可提供效力的最有效的疫苗类型是抗原化抗体疫苗。抗体的抗原化方法由下列步骤组成，即将得自非免疫球蛋白之抗原的肽表位移植到抗体分子的互补决定区(“CDR”)环中。由于CDR环暴露于抗体分子的表面，它们为抗体的抗原性作出了主要的贡献。与上述合成疫苗不同的是，抗原化抗体经由Fc受体靶向抗原呈递细胞，籍此使II类主要组织相容性(MHC)分子的抗原呈递最大化。抗原化抗体也为B细胞提供了连续不断的抗原肽来源以在I类MHC分子中呈递。除了B细胞水平上的免疫原性外，抗原化抗体作为经加工的肽产物起作用以产生Th-细胞免疫原性。因此，本专利技术的目的是提供抗口蹄疫的抗原化抗体疫苗以提供克服了现有技术的一些缺点，较安全，更便宜和/或更有效的疫苗产品，并为公众提供有用的选本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗ＦＭＤ的免疫系统应答，所述疫苗具有ＦＭＤＶ表位之ｃＤＮＡ构建体或其蛋白质对应物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢雍，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]