一种丹参寡糖及其在抗艾滋病、调节免疫和升白细胞中的用途制造技术

本发明专利技术涉及一种丹参寡糖混合物及其有效部位制备方法，所说丹参寡糖混合物含分子质量数分别为５０４、６６６和９０４，含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为１∶８∶７。分离纯化后药效学试验证明，该寡糖混合物及其有效部位具有较好的抗艾滋病、调节免疫和升白细胞的作用。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种丹参寡糖混合物及其和有效部位及其制备方法和及其在抗艾滋病、免疫调节及升白细胞中的用途。
技术介绍
艾滋病以难以遏制的速度在全球范围迅速蔓延，为21世纪人类面临的最严峻的挑战。至今虽有20种抗HIV的药物及高效抗逆转录的联合疗法，成功地降低了艾滋病病毒血浆病毒载量，升高CD4细胞，重建免疫功能，推迟发病，延长生命和减少死亡，但因产生耐药性和毒副作用，尚不能显著提高机体的免疫功能，不能治愈病人，控制流行。目前趋势向在联合治疗中增加免疫药物如白介素2和干扰素等，但因出现毒副反应，而限制其应用。丹参长期以来，丹参在临床用于治疗心脑血管疾病和肝炎。本专利技术发现丹参寡糖混合物及其有效部位具有抗艾滋病病毒，、免疫调节和升高白细胞等药功效，对免疫低下或白细胞减低的艾滋病病毒和机会性感染、乙型肝炎、心肌炎以及其他血液病和肿瘤等疾病可提高治疗效果，有望发展成为有广泛用途的新型药物。中国医学科学院医药生物技术研究所陈鸿珊等于1989年发现丹参(Salviamiltiorrhiza)水提取物具有抗艾滋病病毒和乙型肝炎病毒的作用。对细胞培养内艾滋病毒有抑制作用，小鼠及猴口服可抑制鼠白血病及猴艾滋病病毒感染，在2155细胞培养内抑制乙型肝炎病毒，并证明丹参素能抑制艾滋病病毒，于2000年获中国专利(专利号ZL95105902.5)。该所陈鸿珊与美国Johns Hopkins大学合作发现丹参抗艾滋病病毒抑制HIV整合酶的成分紫草酸和紫草酸B，已于2002年申请国际专利(WO 02/26726)；该所2002年又发现迷迭香酸苷抑制艾滋病病毒及其整合酶，已于2003年12月申请专利(申请号200310117349.5)；至今自从丹参中已分离获得了多种单体化合物，其中涉及水溶性物质以如酚酸性化合物，如丹参素、咖啡酸、丹酚酸A～H以及紫草酸和迷迭香酸等及其聚合物和衍生物，对其制备工艺、抗心脑血管疾和肝炎的专利很多。对丹参注射液，复方胶囊等在小鼠体内和临床病人的免疫调节作用也有文献报导。此外，还有不少关于合成寡糖类化合物具有抗艾滋病、抗肿瘤和免疫调节作用的报告和专利，其中2004年青岛海洋研究院的专利阐述了系自从抗艾滋病病毒海藻多糖911中提取的寡糖具有抑制艾滋病病毒作用。但是迄今未见丹参寡糖及其有效部位抑制抗艾滋病病毒、免疫调节及升白细胞的有关报道和专利。本专利技术制备了丹参有效部位A和B，分离鉴定了有效成分丹参寡糖混合物，其分子质量数分别为504、666和944，其混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比为甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为1∶8∶7。本专利技术对其药理活性试验表明丹参寡糖混合物及其有效部位能抑制艾滋病病毒整合酶和逆转录酶活性及病毒复制，小鼠口服和腹腔注射后，血清有抑制HIV逆转录酶和HIV病毒复制、调节免疫细胞和升高白细胞作用。本专利技术的目的之一是提供抗艾滋病，免疫调节和升高白细胞的丹参寡糖及其有效部位和及其制备工艺；本专利技术的目的之二是提供丹参寡糖及其有效部位在制备抗艾滋病等病毒、提高免疫和升白细胞药物中的用途。
技术实现思路
本专利技术所说的丹参寡糖混合物，其分子质量数分别为504、666和944，其混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比为甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为1∶8∶7。本专利技术所说的丹参寡糖及其有效部位的制备方法，主要包括以下步骤A.水浸提取粗提物；B.粗提物经大孔吸附树脂柱层析分离纯化，获取总有效部位A；C.有效部位的进一步分离与纯化，获得有效部位B；D.进一步纯化后获得有效成分丹参寡糖混合物。步骤一水浸提取粗提物提取过程是把丹参根粉碎，采用无盐水浸渍法，渗滤法提取，自然沉淀、离心或过滤方法初步除去固体杂质，获取粗提液。粗提液减压浓缩后，干燥获取粗提物。步骤二大孔吸附树脂柱层析纯化分离获取有效部位A采用填料制备色谱柱，填料为X-5，SP825，HP20等大孔吸附树脂。1)色谱柱活化采用水、稀酸水、稀酸性缓冲液充分洗涤、溶胀和平衡；2)把粗提液加入柱顶，用无盐水洗涤后，用低级醇水解吸，收集解吸液。解吸液减压浓缩、冷冻或喷雾干燥，获有效部位A。步骤三有效部位A分离与纯化获得有效部位B取有效部位A，用无盐水溶解后，再用乙醇沉淀，沉淀部分用无盐水溶解后上凝胶树脂如sephadex LH-20进行柱层析，无盐水洗脱，分份收集，TLC检查，相同部分合并。洗脱液减压浓缩、冷冻或喷雾干燥，获得有效部位B。步骤四有效部位B分离与纯化获得丹参寡糖混合物有效部位B溶解后上sephadex G-50凝胶树脂等进行柱层析，无盐水洗脱，分份收集，FeCl3和蒽酮试验检查，相同部分合并。洗脱液减压浓缩、冷冻或喷雾干燥，获得丹参寡糖混合物。有效部位和丹参寡糖混合物的鉴别有效部位A和B为棕黄色粉未，FeCl3试验呈阳性反应，蒽酮试验呈阳性反应，莫利希试验呈弱阳性反应，而斐林试剂法检测反应为阴性反应，茚三酮显色反应为阴性反应。丹参寡糖混合物也为棕黄色粉未，FeCl3试验呈阳性反应(蓝褐色)，蒽酮试验呈阳性反应(棕蓝色)。经MALDI-TOF MS测定，丹参寡糖混合物为一混合物，含有分子量分别为504，666和944的物质(图1)。红外光谱分析，含有糖羟基成分(图2)。样品经化学衍生，进行气相色谱分析显示，丹参寡糖混合物含有甘露糖，半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比为甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为1∶8∶7(图3)。丹参寡糖混合物及其有效部位A和B抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性1.对HIV-1整合酶的抑制活性及其作用机制1.1抑制HIV-1整合酶的总活性将供体底物包被试验板，洗板后加入反应缓冲液、不同浓度药液和标定浓度的基因工程HIV整合酶，37℃反应1小时。加入靶底物，混合，37℃反应1小时，洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室温30分钟，洗板。加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温反应1小时，洗板。加显色底物显色30分钟，加0.1N NaOH终止显色反应。酶标仪405nm测定OD值。同时设酶对照和空白对照，计算IC50。1.2抑制HIV-1整合酶3′切割活性测定将包被了供体底物1的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反应缓冲液洗一次。分别加入2×反应缓冲液、不同稀释浓度药液和基因工程HIV整合酶，混匀，37℃反应1小时。PBS洗板，洗去未结合的酶及药物。加入1×反应缓冲液和靶底物，混匀，37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上。1.3抑制HIV-1整合酶链转移活性测定将包被了供体底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反应缓冲液洗一次。分别加入2×反应缓冲液、水和基因工程HIV整合酶，混匀，37℃水浴反应1小时。洗板，洗去未结合的酶。加入2×反应缓冲液、水和不同浓度药液，加入靶底物，混匀，37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上。1.4抑制HIV-1整合酶装配活性测定将包被了供体底物2的微孔板用PBS洗板2次，再用1×反应缓冲液洗一次，分别加入2×反应缓冲液、不同浓度的药液和基因工程HIV整合酶，混匀，37℃水浴反应1小时。洗板，洗去未结合的酶及药物，加入1×反应缓冲液和靶底物，混匀，37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上。1.5丹参寡糖混合物及其有效部位A、B抑制HIV-1IN的作用结果见表1表1.丹参寡糖混合物和有效部位A、B抑制HIV本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丹参寡糖类混合物，其特征是所述混合物中，分子质量数分别为５０４、６６６和９０４，含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为１∶８∶７。

【技术特征摘要】
1.一种丹参寡糖类混合物，其特征是所述混合物中，分子质量数分别为504、666和904，含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖三种糖基，其相对摩尔比甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖为1∶8∶7。2.如权利要求1所述丹参寡糖混合物及其有效部位的制备方法，其特征是将提取物原料丹参粉用水(10～80℃)浸渍或渗滤提取，自然沉淀，离心或过滤初步除去固体杂质，获取粗提液；粗提液经大孔吸附树脂柱层析，用无盐水洗涤，用低级醇水解吸，收集解吸液；解吸液减压浓缩，冷冻或喷雾干燥，获有效部位A；用无盐水溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鸿珊，彭宗根，张丽丽，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]