一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用试剂技术

本发明专利技术是一种降解ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白的方法及所用的试剂。应用０．５～１０μＭ浓度的冬凌草甲素处理Ｋａｓｕｍｉ－１细胞，２～７２小时后可引起ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白的降解。在转染了ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合基因的Ｕ９３７细胞，冬凌草甲素同样可降解ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白。本发明专利技术为开发具有ｔ（８；２１）染色体易位的白血病靶向治疗药物奠定了基础，同时为ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白的生物学功能研究提供了新的途径与试剂，还为拓宽冬凌草甲素的临床／实验研究用途提供了依据。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用试剂。
技术介绍
白血病的发生多与基因组的异常改变有关，某一种(或一些)异常分子可通过多种机制最终引起白血病细胞的恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑制而导致疾病的发生。靶向降解这种(或这些)异常分子自然成为白血病治疗的一种策略，而且这种靶向疗法往往具有疗效高而毒副作用低的特点，是人类赖以征服白血病的有力工具。典型的例子是全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷(ATO)通过降解PML-RARα融合蛋白诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)白血病细胞的分化与凋亡，大大改善了APL患者的预后，使APL成为一种有希望被治愈的白血病。M2型急性髓性白血病(AML M2)占所有急性髓性白血病(AML)的25％，以具有t(8；21)染色体易位为特征，其形成的AML1-ETO融合蛋白是AML M2的发病原因。该病临床表现为发热、贫血、出血及粒细胞肉瘤等症状体征，而外周血中常有白细胞增高，红细胞、血小板减少。治疗上以阿糖胞苷、柔红霉素等化疗为主，而缺少特异针对AML1-ETO融合蛋白的有效治疗方法。开发靶向降解AML1-ETO融合蛋白并诱导t(8；21)白血病细胞凋亡/分化的药物，对进一步改善AML M2患者的临床疗效具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法。本专利技术的另一目的在于提出一种降解AML1-ETO融合蛋白所用的试剂。本专利技术的技术特征是，采用0.5～10μM浓度的冬凌草甲素处理含有t(8；21)染色体易位的Kasumi-1细胞，2～72小时后可引起AML1-ETO融合蛋白的降解；用0.5～10μM浓度的冬凌草甲素处理转染过AML1-ETO融合基因的U937细胞2～72小时，也可引起AML1-ETO融合蛋白的降解。冬凌草甲素降解AML1-ETO融合蛋白的途径有两种，一是活化通过caspases，二是通过ubiquitin途径。研究发现，冬凌草甲素对Kasumi-1、NB4、HL-60、U937、K562等白血病细胞均有增殖抑制作用，但对具有AML1-ETO融合蛋白的Kasumi-1细胞作用最为明显，IC50最低；且冬凌草甲素对BCR-ABL融合蛋白无降解作用，说明其对AML1-ETO融合蛋白的降解有一定的特异性。以上发现为开发具有t(8；21)染色体易位的白血病的靶向疗法奠定了基础，也为研究AML1-ETO融合蛋白的生物学功能提供了新的途径与试剂。比较现有技术，本专利技术具有以下技术特点1，提出一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法和降解AML1-ETO融合蛋白所用的试剂，揭示了四环二萜类化合物新的生物学功能。为开发具有t(8；21)染色体易位的白血病的靶向治疗药物奠定了基础；为研究AML1-ETO融合蛋白的生物学功能提供了新的途径与试剂。2，发现了冬凌草甲素新的生物学效应。冬凌草甲素可降解AML1-ETO融合蛋白并诱导AML M2白血病细胞凋亡，加上其毒副作用低而且价格低廉，因此有较为广阔的临床应用前景。附图说明图1冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白的降解作用图2冬凌草甲素对BCR-ABL融合蛋白的作用。示冬凌草甲素不能降解BCR-ABL融合蛋白，而ATO可对其进行降解。具体实施例方式I、我们用不同浓度的冬凌草甲素(0.5～5μM浓度)处理Kasumi-1细胞24、48小时后提取其蛋白质，进行Western印迹杂交，发现冬凌草甲素可将94kDa的AML1-ETO蛋白降解，降解片段大小分别为70kDa、25kDa左右(见图1)。(1为对照，2～4分别为0.5、2、5μM冬凌草甲素作用24小时后Kasumi-1细胞AML-ETO蛋白的变化，5～7为0.5、2、5μM冬凌草甲素处理48小时后Kasumi-1细胞AML-ETO蛋白的变化。上方箭头所示为AML1-ETO融合蛋白，中下方箭头所示为降解产物。)II、我们用免疫荧光的方法检测经冬凌草甲素处理后Kasumi-1细胞内AML1-ETO及ETO蛋白的分布情况，发现Kasumi-1细胞内AML1-ETO、ETO蛋白的表达明显降低。III、用冬凌草甲素处理转染过AML1-ETO融合基因的U937细胞，再提取其蛋白并进行Western印迹杂交试验，亦发现冬凌草甲素可降解AML1-ETO融合蛋白。IV、我们比较了冬凌草甲素对Kasumi-1、NB4、HL-60、U937、K562等细胞的增殖抑制作用，发现冬凌草甲素对具AML1-ETO融合蛋白的Kasumi-1细胞作用最为明显，IC50最低(表1)。且冬凌草甲素对BCR-ABL融合蛋白无降解作用(图2)，说明其对AML1-ETO融合蛋白的降解有一定的特异性。表1 冬凌草甲素对不同白血病细胞的增殖抑制作用 V、我们用冬凌草甲素(0.5～5μM浓度)处理Kasumi-1细胞，发现其可诱导白血病细胞出现凋亡小体与DNA“梯形”条带，磷脂酰丝氨酸表化与末端脱氧核苷酰转移酶介导的原位凋亡检测阳性，细胞周期出现亚G1峰，这种效应呈剂量-时间依赖性。冬凌草甲素还可引起Kasumi-1细胞线粒体跨膜电位的崩解、caspases的活化及bcl-2癌蛋白表达下降等。对其它白血病细胞株如NB4、HL-60、K562、U937等细胞，冬凌草甲素也可诱导其凋亡，但所需浓度较高，在5～15μM间。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白的方法，其特征在于，采用０．５～１０μＭ浓度的冬凌草甲素处理Ｋａｓｕｍｉ－１细胞或转染了ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合基因的Ｕ９３７细胞，２～７２小时后可引起ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合蛋白的降解。

【技术特征摘要】
1，一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法，其特征在于，采用0.5～10μM浓度的冬凌草甲素处理Kasumi-1细胞或转染了AML1-ETO融合基因的U937细胞，2～72小时后可引起AML1-ETO融合蛋白的降解。2，如权利要求1所述的方法，其特征在于冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白的降解作用包括其对AML1蛋白家族成员的降解作用。3，如权利要求1所述的方法，其特征在于冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈赛娟，周光飚，王振义，陈竺，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]