梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒及其制备，涉及一种试剂盒。试剂盒设载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线、对照线，检测线和对照线设在硝酸纤维膜上；在总抗体和检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人Ig抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Ig抗体。先制备梅毒特异性重组抗原，再制备心磷脂抗原，然后硝酸纤维素膜的点样，制备抗人总特异性片段Ig链单克隆抗体，在标记抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶后制备免疫印迹试剂盒。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体的检测。所需标本量极小，不需特殊仪器，检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印 迹试剂盒及其制备方法。
技术介绍
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播 性疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者 胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎所有 的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏 期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒 是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒依然是 世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患者，其 中60万孕妇患者(林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方 法的选择.中华医院感染学杂志.2010,20(10) :1491-1494)。事实上，梅毒的感染现状可 能要比想象中的更让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试 验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消 失(林丽蓉，但冰，付左根，等.潜在血源传播患者梅毒血清学TRUST/TPPA与IgM抗体 联合检测.中国皮肤性病学杂志.2010，152 (0 =446-448)；而另一种抗体物质反应素产 生较晚，一般在受感染后5 7周产生，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能 阴性，因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后，机 体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定的水 平。Martina H 等(Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清 学标志，李步荣等(李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义 .第四军医大学学报，2007，观(16) :1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA —样，代表着梅 毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅 毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(RaWStr0n SA, Mehta S，Bromberg K，et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specificIgM enzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in thediagnosis ofmaternal and congenital syphilis. Sex Transm Dis，2004，31(2) 123-1 )。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。TP-IgG的出现要迟于IgM，能长期存在，甚至终身不消失，因此，TP-IgG是梅毒诊断和流 行病学调查的一项重要指标(Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu,Bing Dan，et al. Development of a colloidalgold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17 and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，68 :193-200.)。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感 染兔睾丸获得，这种方法存在花费大、获得的TP量少且不纯(混有宿主蛋白)、与其他病原 体存在交叉反应等缺点，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋 体抗原的相继克隆，将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗 原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技 术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗 原。梅毒特异性抗体检测方法包括梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)及免疫印迹技术 (Western-Blot)等，其特异性均较高。一般地，TPPA，ELISA作为临床初筛，当血清学阳性， 或临床诊断有困难时，需要采用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作为确认试验。其中，FTA-ABS需 要荧光显微镜，而且其结果判断需要训练有素和较丰富经验的专业人员才能完成，因此，其 应用推广受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完 成，不需要特殊设备，判读也简单明了。现市售的ffestern-blot试剂均为进口试剂，价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒及其 制备方法。本专利技术所述梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒设有载体板、硝酸纤 维膜、梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线、对照线，梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检 测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线处包被梅 毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人Ig抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Ig 抗体。所述梅毒特异性重组抗原可为TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47等。所述载体板可采用PVC板。所述梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，包括以下步 骤1)制备梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒特异性重组抗原；2)制备心磷脂抗原猪心肌组织经低温速冻后风干，研磨成粉状后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通过硅 胶层析柱洗脱，提取纯度95%以上的心磷脂抗原；3)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜总抗体检测线上包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照 线处包被人Ig抗体，晾干；4)制备抗人总特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线、对照线，梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人Ｉｇ抗体；辣根过氧化物酶标记抗人Ｉｇ抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张忠英，杨天赐，林丽蓉，刘莉莉，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：92
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