抗甲状腺素（Ｔ４）单克隆抗体制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗甲状腺素（Ｔ４）单克隆抗体制备与应用，提供了一种抗甲状腺素（Ｔ４）单克隆抗体的制备方法，使用ＢＳＡ同Ｔ４偶联，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，经细胞融合、选择性培养、筛选、细胞克隆，筛选出抗Ｔ４单克隆抗体杂交瘤细胞系，制备腹水，并进行纯化，制备出抗Ｔ４单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗甲状腺素(T4)单克隆抗体制备与应用。
技术介绍
甲状腺素(thyroxine，T4)是一种由甲状腺细胞合成和分泌的激素，每日T4产量 的约80%要在外周组织脱碘酶(5’-脱碘酶或5-脱碘酶)的作用下产生T3，是T3的主要来 源。甲状腺素的生理作用十分广泛，影响机体的生长发育、组织分化、物质代谢，并涉及到神 经系统、心脏等多种器官、系统的功能。T4的分泌受下丘脑-垂体-甲状腺轴系统控制。T4 释放入血之后，以两种形式在血液中运输，一种是与血浆蛋白结合，另一种则呈游离状态， 两者之间可互相转化，维持动态平衡。外周血中99. 96%的T4都与结合蛋白结合，游离的 甲状腺激素在血液中含量甚少，然而正是这些游离的激素才能进入细胞发挥作用，结合型 的甲状腺激素是没有生物活性的。能与甲状腺激素结合的血浆蛋白有三种甲状腺素结合 球蛋白(thyroxine-binding globulin，TBG)、甲状腺素结合前白蛋白(thyroxine-binding prealbumin, TBPA)与白蛋白。从诊断学讲，血液循环系统甲状腺激素的水平，常常反应甲状腺的功能，测定血清 中T4的浓度能较正确地判断甲状腺的功能状态。从判断甲状腺功能而言，T4仍然是目前 最常用的检查指标，在检查甲状腺功能低下时，血清T4含量是最好的单项指标，与TSH联合 使用是当前诊断新生儿先天性甲低的唯一方法。甲状腺功能亢进的病人，T3、T4均可升高， 但有部分甲亢病人，血清Τ4值正常，而Τ3值却高于正常，可诊断为“Τ3型甲亢”。临床上检测Τ4多是采用放免方法，近年化学发光(CLIA)等非放技术也日渐成熟， 它们多使用抗Τ4多克隆抗体。但是使用多克隆抗体的CLIA技术其灵敏度不高，特异性较差，批次间变异较大。 因此，需要开发特异性抗Τ4单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗甲状腺素(Τ4)单克隆抗体的制备方法。使用BSA同 Τ4偶联，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、选择性培养、筛选、细胞克隆，成功地筛选出抗Τ4单 克隆抗体杂交瘤细胞系，制备腹水，并进行纯化，制备出抗T4单克隆抗体。具体实施例方式1)免疫原制备EDC法连接T4与BSA。2)动物免疫将T4-BSA与福氏佐剂等量混合充分乳化后注射BALB/c小鼠，每只 小鼠400 μ g，共免疫3次。3)细胞融合、选择性培养、筛选融合前3天，小鼠腹腔注射无佐剂T4_BSA400y g， 按常规方法进行细胞融合、HAT选择性培养，用RIA法进行筛选。4)细胞克隆选择阳性细胞孔进行细胞克隆，使用有限稀释法，克隆共3次，最后得到抗T4单克隆抗体杂交瘤细胞系6株，扩大培养后，冻存。 5)腹水制备按常规杂交瘤技术制备腹水。6)纯化，制备抗Τ4单克隆抗体使用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，制备出抗Τ4 单克隆抗体。7)特性鉴定将待检验的Τ4单克隆抗体用含I % BSA磷酸盐缓冲液稀释成IOug/ ml，加IOOul到羊抗鼠包被酶联板孔中，37°C温育1小时，洗涤后按北方所T4ELISA试剂盒 操作50ul标准+50ul生物素化T4，37°C温育1小时。洗涤，加入50ul酶标亲和素，37°C温 育半小时，洗涤，加入显色底物，酶标仪测450nm处OD值。检测结果T4_2，T4-4有较好结 合，标准曲线抑制好。亚类均为IgGl亲和常数T4-21. 9 X 10nl/mol, T4-4 2. lX1010l/mol交叉反应与T3交叉反应<竞争CLIA的建立及相关指标应用本专利技术的T4单克隆抗体建立T4化学发光检测 方法(竞争法)，平均回收率在90-110%;剂量-反应曲线相关系数的绝对值(|r|)不低于 0. 9900 ；分析内精密度(CV% )不高于15. 0% ；分析间精密度(CV% )不高于20. 0% ；分析 灵敏度不高于lOng/ml ；与其类似物的交叉反应不影响T4测值；有效期12个月。权利要求1. 一种抗甲状腺素(T4)单克隆抗体制备 步骤如下1)免疫原制备EDC法连接T4与BSA；2)将T4-BSA与福氏佐剂等量混合充分乳化；3)无佐剂T4-BSA400 μ g，按常规方法进行细胞融合、HAT选择性培养，用RIA法进行 筛选；4)细胞克隆选择阳性细胞孔进行细胞克隆，使用有限稀释法，克隆共3次，最后得到 抗T4单克隆抗体杂交瘤细胞系6株，扩大培养后，冻存；5)腹水制备按常规杂交瘤技术制备腹水；6)纯化，制备抗T4单克隆抗体使用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，制备出抗T4单克 隆抗体。全文摘要本专利技术涉及一种抗甲状腺素(T4)单克隆抗体制备与应用，提供了一种抗甲状腺素(T4)单克隆抗体的制备方法，使用BSA同T4偶联，免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、选择性培养、筛选、细胞克隆，筛选出抗T4单克隆抗体杂交瘤细胞系，制备腹水，并进行纯化，制备出抗T4单克隆抗体。文档编号C07K16/26GK102093478SQ20091025047公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日专利技术者于爽, 曾玲 申请人:北京北方生物技术研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗甲状腺素（Ｔ４）单克隆抗体制备：　　步骤如下：　　１）免疫原制备：ＥＤＣ法连接Ｔ４与ＢＳＡ；　　２）将Ｔ４－ＢＳＡ与福氏佐剂等量混合充分乳化；　　３）无佐剂Ｔ４－ＢＳＡ　４００μｇ，按常规方法进行细胞融合、ＨＡＴ选择性培养，用ＲＩＡ法进行筛选；　　４）细胞克隆：选择阳性细胞孔进行细胞克隆，使用有限稀释法，克隆共３次，最后得到抗Ｔ４单克隆抗体杂交瘤细胞系６株，扩大培养后，冻存；　　５）腹水制备：按常规杂交瘤技术制备腹水；　　６）纯化，制备抗Ｔ４单克隆抗体：使用辛酸－硫酸铵沉淀法进行纯化，制备出抗Ｔ４单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于爽，曾玲，
申请(专利权)人：北京北方生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]