分离Ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种分离ＩＩＩ型前胶原氨基末端肽的方法，解决了ＩＩＩ型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题，采用硫酸氨分级分离发法，第一步将杂质减少了５．５％，而得率增加了１１．７％，采用Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ，上样量大，流速快，进一步分离未采用ｐＨ４．５和ｐＨ８．５的缓冲液变换洗脱，而采用对蛋白有保护作用的疏水层析，纯度和活性大大提高，用高分辨率的Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００代替Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ２００，进一步提高纯度，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析纯度达９８％，活性是现有技术的１０倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分离II I型前胶原氨基末端肽的方法。
技术介绍
现有的提纯方法是都采用了 DEAE-S印hacel离子交换柱及S印hacryl分子筛， 经验证此法纯化效率不高，杂蛋白与活性峰分不开，而且纯化的pIIIINP活性不高，活 性下降极快，纯度无法满足高精度实验要求。最主要是，得率太低，经测算(RIA-Gnost Prokollagen-III-Peptid)，用此法提纯95 %的PIIINPlmg需要PIIINP的有效含量达 IOOmg以上。第一步加(NH4) 2S04没有分级将大部杂质带入后续阶段，而且这一步也仅能去掉 10%的杂蛋白。纯化前40%(NH4)2S04 1 20%~48%(NH4)____2SQ4_孑iiinp 含量 ~Tmg一 0.826mg0.923m^~、蛋白 —IOOOmg900mg850mg上述方法所用的DEAE-S印hacel离子交换柱及S印hacryl分子筛分辨率不高是造 成纯度低、效率低的主要原因，长时间采用pH4. 5和pH8. 5的缓冲液洗脱及未完全去除的杂 质导致pIIIINP活性不高。采用(NH4) 2S04沉淀，二次不同pH的及S印hacel S-200分子筛柱层析从人癌性 腹水中分离并纯化了 PIIINP，并制备了抗血清，经取癌性腹水3L，加固体(NH4) 2S04到40% 饱和度，搅拌过夜，静置4h，16000g离心20min，弃上清液，将沉淀溶于50mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,2mmol/LNEM,2mmol/LPMB,lmmol/LPMSF, 2mmol/L ICH2C00Na,2mmol/ L(NH2)2C0的缓冲液中，pH8. 6。并与该缓冲液做充分透析，以除去样品中的(NH4)2S04。 经DEAE-S印hacel离子交换柱层析，用上述缓冲液做NaCl阶段洗脱。洗脱后的活性峰部 分与lOmmol/L柠檬酸盐缓冲液pH4. 5充分透析后，25000g离心60min。取上清液，再经DEAE-S印hacel离子交换柱，用0-0. 6mmol/LNaCl, 10mmol/L柠檬酸盐缓冲液pH4. 5作线性梯度洗脱，在232nm处检测蛋白峰，用西德PIIIP药盒检测PIIIP活性峰，合并活性峰 部分，与10mmol/LNH4HC03充分透析后，冷冻干燥，经S印hacryl S-200分子筛柱层析，收集 PIIIP活性峰，合并，与10mmol/LNH4HC03充分透，分装，冷冻干燥，置-20C保存。全部提纯 过程均在4-8C下进行。上述方法的缺点1)纯化效率、纯度不高，杂蛋白与活性峰分不开； 2)纯化的pIIIINP活性不高，活性下降极快。
技术实现思路
本专利技术是要解决III型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问 题。采用硫酸氨分级分离发法，第一步将杂质减少了 5.5%，而得率增加了 11.7%。采用Qsepharose FF，上样量大，流速快，分辩高，大大提高了效率。进一步分离未采用pH4. 5和 PH8. 5的缓冲液变换洗脱，而采用对蛋白有保护作用的疏水层析，纯度和活性显著提高，用 高分辨率的Superdex200代替S印hacryl200，进一步提高纯度。经SDS-PAGE分析纯度达 98%，活性是现有技术的10倍。具体实施例方式为了获得免疫活性好的抗体，从人癌性腹水中提取PIIINP，免疫家兔。取癌性病 人腹水2升，10000RPM离心，目的是去掉组织块和癌性细胞；这一步必须穿戴防护手套和眼 镜， 因为决大多数肝癌病人都携带肝炎病毒；俯■至"40 60% (ffi縣醜λ·靴)白侧定，加 后要搅拌i寸夜，10000RPM离心，收集沉淀，弃卜.清由于腹水杂蛋白含量达80mg/ml，而有效含量60 600ng/ml，仅为百万分之一，所 以直接用柱层析方法是不可能将痕量的PlIINP分离出来。根据序列分析，PIIINP的等电 点为 5. 71。因此，用BufferA透析上述沉淀并使浓度为lmg/ml，调溶液的pH为5. 6，搅拌 4个小时，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；用BufferA透析上述沉淀并使浓度为lmg/ml，上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同 时，收集40 60% (BufferB)部分；上述收集物用BufferC (0. Im HAC-NaAC, pH4. 4)透析，上阳离子交换柱 CM-S印haroseFF，去掉酸性蛋白的同时，用BufferC和BufferA进行梯度洗脱，收集20 50 馏分；浓缩成5mg/ml，取200ul上superdex200分子筛层析，收集45KD位置的峰，浓缩成 lmg/ml，加入叠氮钠，PMSF，最后进行纯度鉴定和免疫学鉴定，将合格品保存；用法国CIS公司的三型前胶原肽免放药盒0CFK07-PIIIP (国家食品药品监督管理 局特殊药品进口准许证P-04-05-27-03)检验各峰中PIIINP的含量，获得纯度高的PIIINP 进行免疫。用PIIINP-R和PIIINP-Ag分别标记125I然后替代药盒中的相同组份，检验试剂盒 的各种组分。结果PIIINP-R组总有部分(且只有部分)组分完全符合免疫学检验对药盒 的各项指标，但BO偏低。而PIIINP-Ag各项指标BO达到70以上，但非特异稍高。本专利技术解决了 III型前胶原氨基末端肽的提取方法的问题。首先在初提阶段增加 20%硫酸氨分级沉淀为以后的进一步分离奠定了基础。选用高分辩率的Qsepharose FF(阴 离子交换柱)Superdex200 (分子蹄层析)。选用 Phenylsepharose Highperformence (疏 水层析柱)，避免用PH4. 5和pH8. 5的缓冲液变换洗脱。选用Qwpharose FF(阴离子交换 柱)Phenyls^harose Highperformence (疏水层析柱)，使分离效率大大提高。离子交换和 分子筛层析选用高分辩率的Qs印harose FF (阴离子交换柱)SuperdeUOO (分子筛层析)， 使得纯度的提高。避免用PH4. 5和pH8. 5的缓冲液变换洗脱，通过提高纯度提高活性。权利要求1. 一种分离III型前胶原氨基末端肽的方法离体腹水2升,提取PIIINP, 10000RPM离心，收集硫酸氨浓度汰到40 60%的馏分，方 法为加入硫酸氨后搅拌过夜，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清；用BufferA透析上述沉淀 并使浓度为lmg/ml，调溶液的pH为5. 6，搅拌4个小时，10000RPM离心，收集沉淀，弃上清； 用BufferA透析上述沉淀并使浓度为lmg/ml，上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同时，收集 40 60%即BufferB部分；上述收集物用BufferC 0. Im HAC-NaAC, pH4. 4透析，上阳离子 交换柱CM-kpharoseFF，去掉酸性蛋白的同时，用BufferC和BufferA进行梯度洗脱，收集 20 50馏分；浓缩成5mg/ml，取200ul上superdex200分子筛层析，收集45KD位置的峰， 浓缩成lmg/ml，加入叠氮钠，PMSF。全文摘要本专利技术涉及一种分离III型前胶原氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离Ⅲ型前胶原氨基末端肽的方法：　　离体腹水２升，提取ＰⅢＮＰ，１００００ＲＰＭ离心，收集硫酸氨浓度达到４０～６０％的馏分，方法为加入硫酸氨后搅拌过夜，１００００ＲＰＭ离心，收集沉淀，弃上清；用ＢｕｆｆｅｒＡ透析上述沉淀并使浓度为１ｍｇ／ｍｌ，调溶液的ｐＨ为５．６，搅拌４个小时，１００００ＲＰＭ离心，收集沉淀，弃上清；用ＢｕｆｆｅｒＡ透析上述沉淀并使浓度为１ｍｇ／ｍｌ，上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同时，收集４０～６０％即ＢｕｆｆｅｒＢ部分；上述收集物用ＢｕｆｆｅｒＣ　０．１ｍ　ＨＡＣ－ＮａＡＣ，ｐＨ４．４透析，上阳离子交换柱ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ，去掉酸性蛋白的同时，用ＢｕｆｆｅｒＣ和ＢｕｆｆｅｒＡ进行梯度洗脱，收集２０～５０馏分；浓缩成５ｍｇ／ｍｌ，取２００ｕｌ上ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分子筛层析，收集４５ＫＤ位置的峰，浓缩成１ｍｇ／ｍｌ，加入叠氮钠，ＰＭＳＦ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉军，
申请(专利权)人：北京北方生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]