本发明专利技术涉及经植物生产的用作疫苗等的植物病毒。更明确地，本发明专利技术涉及简单的灭活方法和借此获得的植物病毒颗粒。本文公开的发明专利技术提供生产基于在灭活植物病毒样颗粒表面上的衍生自致病体表位展示的安全疫苗的手段和方法。本发明专利技术披露了嵌合植物病毒颗粒的灭活和将灭活步骤整合入病毒颗粒的纯化中。灭活方法提供不能感染植物且保留了病毒颗粒完整性的病毒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术通常涉及植物生产的用作疫苗等的植物病毒。更具体地，本专利技术涉及病毒灭活方法以及作为疫苗等的植物病毒颗粒。
技术介绍
疫苗接种能保护个体和整个种群免于传染源的危害。然而，由于从有效抗原的鉴定到对开发的疫苗的安全性的关注的大量原因，开发安全有效的疫苗不总是简单的。在复合(composite)病毒疫苗领域中已经探究了使用病毒做为外源肽载体。这样的疫苗基于是不同动物病毒组分的杂种的嵌合病毒。通常，这样的杂种的主要组分衍生自无害或已经将其无害化的病毒，且次要组分是选择的病原性病毒的抗原组分。例如，可将痘病毒如牛痘或减毒脊髓灰质炎病毒用作其它动物病毒包括人类病毒的免疫原组分的载体。然而，上面讨论的这样的技术有缺点。这样的疫苗产自培养在其设计和运行是昂贵的细胞培养系统中的病毒。复合病毒方法涉及活的感染动物的病毒的操作，具有突变可能引起具有改变的感染性、抗原性和/或致病性的新型病毒的风险。此外，用作载体的动物病毒能是动物可能已经暴露于其且病毒可能已经产生针对该载体的抗体的病毒。因此，在第二病毒的混合抗原位点诱导免疫反应前，免疫系统能摧毁5载体。已经为哺乳动物病毒灭活使用了大量方法。这些方法包括紫外线照射、紫外线/补骨脂素(psoralen)照射、戊糖化学药(Pentose Pharmaceuticals chemicals)、微波、福尔马林、BPL、 pH、温度和氯化铵孵育。已经使用了紫外线照射来灭活重组植物病毒。参见例如， Langeveld d a/. (2001) Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus, 松cc/e 19:3661-3670。涉及产生该颗粒的方法以及该颗粒的用途，特别地用作疫苗的专 利包括美国专利No.6，110,466，该专利讨论了含有预设的外源肽作为病 毒衣壳蛋白部分的植物病毒的组装颗粒和美国专利No.6，884，623，该专 利讨论了在病毒衣壳蛋白中包含外源肽的植物病毒的组装颗粒，其中 插入位点优选地游离于位于插入位点两侧的直接的序列重复。美国专利No.5，602，242涉及用于在异源，优选杆状衣壳的蛋白衣 壳内的遗传工程化的病毒序列的衣壳化的重组RNA病毒。该专利也涉 及这样的重组病毒的制造和使用，特别是关于带来植物中基因型和表 型改变的病毒转染。在Ahlquist W a/. (1981) Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Virus RNA3， 《/ Afo/.153:23-38中公开了删除或灭活病毒衣壳蛋白基因的方法。Burge a a/.， Effect of Heat on Virus Inactivation by Ammonia, 五v/ra. M/m 6/o/ow, Aug 46(2):446-51， 1983讨论了热以及氯化铵对 病毒灭活的效果。研究了噬菌体￡2和脊髓灰质炎病毒1 (包膜的哺乳 动物病毒)。发现高于40。C的温度损害了本文试验的病毒。像Burge等 人~样，Cramer WN, d a/. Kinetics of virus inactivation by ammonia,五v/ra A^cra6/o/ogy, Mar 45(3):760-5, 1983为了灭活病毒，使用 在一系列pH值范围内的氯化铵处理污水。再一次地，研究了噬菌体G 和脊髓灰质炎病毒l (CHAT株)。据报告那些试验结果显示，NH/浓 度对脊髓灰质炎病毒灭活率的效果远低于对f2的灭活率的效果，假如 并非如此。本文讨论了该方法学在污水处理植物作为氯的可能替代的 应用，特别是对于肠道病毒群成员。
技术实现思路
本专利技术包括通过给予硫酸铵到大于pH 8.0的、选自植物、植物组 织、植物细胞或原生质体的植物材料，产生灭活病毒样颗粒(VLP); 孵育植物材料至少十个小时；然后从植物材料收获灭活病毒样颗粒而 生产灭活植物病毒的方法。这些方法能包括外源肽整合到病毒中。该 病毒能处于非包膜RNA病毒内。灭活VLP能提呈异源生物活性肽。 以0.5M至(J l.OM，通常0.7M浓度给予硫酸铵。pH通常是9.0，且能 在室温下孵育植物材料。因为VLP缺少至少部分存在于植物病毒中的 RNA， VLP不具有感染性。此外，在接种时它不启动感染并且不能复 制。本专利技术也包括嵌合植物病毒颗粒的灭活以及将灭活歩骤整合到病 毒颗粒纯化过程。灭活方法提供了不能感染植物的病毒。保留了病毒 颗粒的完整性，同时摧毁了存在于病毒颗粒内的感染性病毒基因组 RNA。这些方法能够量化，且能整合到纯化程序中。本专利技术也包括通过给予硫酸铵到pH大于8.0的、选自植物、植物 组织、植物细胞或原生质体并缺少至少部分存在于植物病毒内的RNA 的植物材料；孵育植物材料至少十个小时；并从植物材料收获灭活的 不能复制的VLP而产生非感染VLP的方法。此外，本专利技术的实施方案也包括疫苗，其中疫苗包括病毒且该病 毒包括整合到病毒内的外源肽，且通过包含在大于8.0的pH，将硫酸 铵加到选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体的植物材料；孵育 植物材料至少十个小时；然后从植物材料收获灭活的VLP的方法产生 疫苗。当将VLP给予到哺乳动物时，提呈的VLP肽能激发免疫反应。 會鹏该疫苗用于流感病毒、东方马脑炎病毒(eosf簡，/e ecep/za/他virus )、犬细小病毒(Cam'e戸rvov/n/力或炭疽杆菌(Sac/〃ws af/zrac/力。此外，该疫苗可以是亚单位疫苗，其中肽是抗原的一部分且该部分是 疫苗的有效部分。附图说明图1:显示了抽提自活的PA10病毒和灭活的PA10病毒的RNA跑 1.2%琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色，说明了活病毒中CPMV基因组RNA1和2以及灭活病毒制备物中的降解的RNA。 图2:显示了PA7E的AIEC色谱图。 图3-5:证明了PA9、 PA11和PA18的RNA灭活。 图6:显示了 PAIS的5天温度稳定性的SDS-PAGE胶。 图7:显示了通过ELISA检测的CPMV-PA免疫的猴子中的抗-PA抗体。图8:显示了 140天时血清和支气管灌洗中的抗-PA抗体(IgG)。 序列简要说明SEQIDNO:l是根据本专利技术实施例3使用的表位PA1的肽序列。 SEQ IDNO:2是根据本专利技术实施例3使用的表位PA2的肽序列。 SEQIDNO:3是根据本专利技术实施例3使用的表位PA3的肽序列。 SEQ ID NO:4是根据本专利技术实施例3使用的表位PA3E的肽序列。 SEQ IDNO:5是根据本专利技术实施例3使用的表位PA4的肽序列。 SEQ ID NO.6是根据本专利技术实施例3使用的表位PA5的肽序列。 SEQ IDNO:7是根据本专利技术实施例3使用的表位PA6的肽序列。 SEQ IDNO:8是根据本专利技术实施例3使用的表位PA7的肽序列。 SEQ IDNO:9是根据本专利技术实施例3使用的表位PA7E的肽序列。 SEQ ID NO: 10是根据本专利技术实施例3使用的表位PA8的肽序列。 SEQIDNO:ll是根据本专利技术实施例3使用的表位P本文档来自技高网...
【技术保护点】
灭活植物病毒的方法，包括： ｐＨ值大于８．０时，向表达病毒样颗粒的植物材料给予硫酸铵，其中，植物材料选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体； 孵育植物材料至少十个小时以生产灭活病毒样颗粒；和 从植物材料收获灭活病毒样颗粒。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2005-12-2 60/742,1971、灭活植物病毒的方法，包括pH值大于8.0时，向表达病毒样颗粒的植物材料给予硫酸铵，其中，植物材料选自植物、植物组织、植物细胞或原生质体；孵育植物材料至少十个小时以生产灭活病毒样颗粒；和从植物材料收获灭活病毒样颗粒。2、 根据权利要求1所述的方法，进一步包括至少一条整合入病毒的外 源肽。3、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的病毒是非包膜RNA病毒。4、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的灭活病毒样颗粒提呈异源 生物活性肽。5、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的肽是抗原。6、 根据权利要求1所述的方法，其中所述的肽是表位。7、 根据权利要求1所述的方法，其中以0.5 M到1.0 M浓度给予硫酸 铵。8、 根据权利要求1所述的方法，其中pH是9.0。9、 根据权利要求l的方法，其中在1(TC到4(TC间孵育植物材料。10、 根据权利要求2所述的方法，其中所述的方法包括在pH 7的0.7 M (NH4) 2S04中将植物病毒结合到疏水相互作用色谱柱上、用pH9的0.7M (NH4)2S04洗涤结合的病毒，并用pH9的0.7M (NH4) 2S04洗脱所述病毒。11、 根据权利要求1所述的方法，其中该病毒具有二十面体的衣壳。12、 根据权利要求1所述的方法，其中该病毒是来自选自雀麦花叶病 毒科、豇豆花叶病毒科或番茄丛矮病毒科的科的病毒。13、 根据权利要求1所述的方法，其中病毒是来自选自雀麦花叶病毒 组、豇豆花叶病毒组、番茄丛矮病毒组、苜蓿花叶病毒组或南方菜豆 花叶病毒组的属的病毒。14、 根据权利要求1所述的方法，其中病毒选自豇豆花叶病毒、豇豆褪绿斑驳病毒、番茄丛矮病毒、苜蓿花叶病毒、雀麦草花叶病毒或南 方菜豆花叶病毒。15、 根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：L拉索霍娃，JP费尔普斯，
申请(专利权)人：陶氏环球技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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