一种壳聚糖的病原微生物灭活方法技术

一种壳聚糖的病原微生物灭活方法，属于生物材料加工技术领域。本发明专利技术是采用ＮａＯＨ溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密封，在－２０～３０℃条件下进行１０～５０ｋＧｙ的γ－射线辐照，将壳聚糖中可能存在的病原微生物灭活，保证壳聚糖作为生物材料的安全性。与现有病原微生物灭活方法相比，本发明专利技术具有在保证有效杀灭细菌、病毒等病原微生物的同时，壳聚糖的脱乙酰度、结晶度等质量指标不变，分子量的降低程度显著低于其他灭活方法，在保证有效的杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持该生物材料的质量和功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及壳聚糖，尤其涉及，属于生物材料 加工

技术介绍
壳聚糖化学名为聚(1，4) -2-氨基-2-脱氧-β -D-葡聚糖，主要由广泛存在于节 肢动物外壳和真菌类细胞壁中提取的甲壳素经脱乙酰化制得，是一种天然氨基多糖。因其 具有良好的生物相容性、生物降解性，壳聚糖在生物材料、医药、食品等领域有广泛应用。但 壳聚糖来源于动物体，可能被从病毒到细菌等各种病原微生物污染；同时壳聚糖在加工、储 藏中也可能因仪器和器皿、试剂、生产环境等因素的影响，受到细菌、病毒等病原微生物的 污染。如果这些污染物被传播给人，将会引起严重的健康问题。这些污染物还可能降低甚 至破坏所污染的材料。现有生物材料的细菌灭活方法包括干热、湿热、过滤等；病毒灭活方法包括S/D法 (有机溶剂/表面活性剂法)、过滤法、加热法、环氧乙烷等。它们在生物材料灭菌等的应用 可参见专利CN1225020A、专利申请200910209501. X等。但这些方法对壳聚糖病原微生物的灭活有局限性S/D法仅对包膜病毒有效；加 热法对耐热病毒效果差，并且实验发现加热会引起壳聚糖产品的降解170°C 2小时干热 灭菌后壳聚糖由类白色变为棕色；120°C 4小时干热灭菌后壳聚糖变为棕黄色，分子量降低 至初始的27. 6% ；121°C湿热灭菌后壳聚糖由类白色变为黄色，分子量降低至初始的56. 8%。 烷基化剂可能引起材料的降解等反应。过滤法对高粘度的产品如壳聚糖也不适用。Y-射线是一种由亚原子粒子相互作用产生的电磁辐射，它对各种微生物均有杀 灭作用，包括有包膜和无包膜病毒及所有的基因型物质。与传统的细菌、病毒灭活方法相比 较，Y-射线辐照有其独特的优点1、不使物品升温，适用于忌热物品的消毒，除某些塑料、 活细胞及其制剂外，许多医用物品都可用它进行消毒灭菌。2、穿透力强。射线可穿透被照 物品的各个部位，一般不受物品包装、形态的限制。3、被照物品不会产生感生放射性，辐照 后无残留毒性，方法简便。4、省能，尤其适于大规模工业化处理。由于上述优势，Y-射线辐 照在生物材料中对细菌和病毒的灭活应用也越来越多，如专利CN1665388A、CN101757651A、 CN1628860A。一般情况下，20 50kGy剂量的、-射线辐照几乎能灭活所有的细菌和病毒。方 月娥等报道采用2. 5 20kGy Y _射线辐照壳聚糖膜可灭活金葡菌和枯草芽孢杆菌，同时辐 照引起了壳聚糖分子量降低，但具体数值未报道。病毒灭活需要的辐照剂量大于灭菌需要 的剂量。辐照剂量越大，对生物大分子材料的损伤也越大。Choi等报道壳聚糖溶液2-10kGy 辐照后，分子量急剧下降，IOOkGy以上辐照时溶液变为棕色。Gryczka等报道壳聚糖固体在 6. 3 300kGy辐照后分子量下降并结晶性发生变化，14. 4kGy辐照后分子量即降低至初始 分子量的30%，300kGy辐照后分子量仅为初始分子量的2. 9%。Kang等报道壳聚糖溶液辐照 后结晶度降低。这些分子量、结晶度等的变化会显著影响壳聚糖的质量，限制其作为生物材料的应用。可见，对壳聚糖进行病原微生物灭活的关键在于彻底进行灭活的同时，尽最大限 度地减小对材料的生物活性和结构的影响是非常重要的。因此，寻找一种能灭活所有病毒， 同时对壳聚糖质量影响较小，操作方便的方法，将有助于提高壳聚糖产品的安全性，并保证 其质量适合作为生物材料使用。NaOH溶液能够灭活病原微生物，但由于很多生物材料不耐受强碱，其应用很少见。 壳聚糖对NaOH稳定，但由于壳聚糖不溶于碱，水相中的NaOH难以灭活包裹在壳聚糖固体颗 粒内部的病原微生物，受这样一个两相体系的限制难以完全灭活病原微生物，所以该方法 对壳聚糖中病原微生物灭活有很大的局限性。综上所述，壳聚糖来源于动物体，涉及病毒以及传染性病原体等的风险。现有生物 材料的细菌灭活方法不适用于壳聚糖。Y“射线是一种有效灭活壳聚糖中病原微生物的方 法，但完全灭活壳聚糖中的病原体需要较高的辐照剂量，高剂量时对壳聚糖的降解较为显 著，对其质量有一定影响。NaOH灭活壳聚糖中病原微生物受到两相体系的限制有很大局限 性。因此，寻找一种能灭活所有病毒，同时对壳聚糖质量影响较小，操作方便的方法，将有助 于提高壳聚糖产品的安全性。
技术实现思路
本专利技术是为了克服现有病原微生物灭活技术在壳聚糖的病原微生物灭活中的缺 陷而提供的一种在保证有效杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持壳聚糖的功能和性质 的病原微生物灭活方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案来实现采用NaOH溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密 封，控温辐照。所述的初步灭菌，采用质量浓度4. 0% 40%的NaOH溶液，NaOH溶液与壳 聚糖用量质量比为20 50 1，温度为室温至100°C，初步灭菌至菌落总数小于IOOOcfu/ g;然后过滤，水洗至中性。所述的干燥是包括但不限于常压干燥、减压干燥、冷冻干燥等方式，使壳聚糖含水 量小于10%。所述的充氮密封是取一定量壳聚糖至适当的容器中，充氮气并立即密封，以降低 氧的分压，减少辐照产生的活性氧，减少辐照对壳聚糖的降解。所述的控温辐照是指密封后的壳聚糖在温度-20 30°C条件下，以10 50kGy的 Y-射线辐照。控温辐照后壳聚糖中的壳聚糖中感染性病毒的残留滴度<0. 5 Ig TCID50 ；菌落数 降低至彡10cfu/g。本专利技术的有益效果与现有技术相比，本专利技术通过NaOH溶液初步灭活病原微生 物，降低壳聚糖的生物负载；然后通过10 50kGy的Y -射线辐照即可实现无菌无病毒，避 免了高剂量辐照。因此壳聚糖的脱乙酰度、结晶度等在灭活前后维持不变，分子量降低幅度 显著低于其他病原微生物灭活方法；也避免了其他灭活方式引起壳聚糖降解或难以完全灭 活等缺点。在保证有效杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持壳聚糖的质量和性能，灭活后壳聚糖产品适用于作为生物材料使用。具体实施例方式实施例1取壳聚糖样品1份，依次加入约107cfu/g短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)，约 107cfu/g枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)和约 IO6TCID50/ g的猪细小病毒(PPV)，lg/瓶分装。加入4. 0%Na0H溶液，NaOH溶液用量与壳聚糖比为20 1，80°C保温，使灭菌至菌落总数小于lOOOcfu/g。过滤，水洗至中性，安瓿瓶分装，冷冻干 燥，干燥后水分含量9.6%。充氮气，立即密封。-20°C进行50kGyY-射线辐照。辐照后采 用 Reed-muench TCID5tl 法测定病毒滴度降低(total reduction factor, TRF)情况，并测 定菌落数降低的情况。实验结果表明4.0%Na0H溶液80°C初步灭活后50kGy Y -射线辐照，PPV的残留滴 度<0.5 Ig TCID5tl，菌落数降低至< lOcfu/g。同时灭活前后壳聚糖结晶度分别为36.4%、 36. 7%、脱乙酰度均为84. 2%，分子量降低为初始分子量的76. 6%。实施例2壳聚糖的准备同实施例1。用NaOH溶液质量浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖的病原微生物灭活方法，其特征在于采用ＮａＯＨ溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密封，控温辐照；步骤为：（１）采用ＮａＯＨ溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活：所述的ＮａＯＨ溶液质量浓度为４．０％～４０％，ＮａＯＨ溶液与壳聚糖质量比为２０～５０︰１，温度为室温至１００℃，初步灭活至菌落总数小于１０００ｃｆｕ／ｇ；然后过滤，水洗至中性；（２）所述的干燥：采用常压干燥、减压干燥、或冷冻干燥，使壳聚糖含水量小于１０％；（３）所述的充氮密封：取一定量壳聚糖至适当的容器中，充氮气并立即密封，以降低氧的分压，减少辐照产生的活性氧，减少辐照对壳聚糖的降解；（４）所述的控温辐照：密封后的壳聚糖在温度－２０～３０℃条件下，以１０～５０ｋＧｙ的γ－射线辐照；经控温辐照后，壳聚糖中感染性病毒的残留滴度≤０．５　ｌｇ　ＴＣＩＤ５０；菌落数降低至≤１０ｃｆｕ／ｇ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张家骊，夏文水，李博，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]